魯佩瑤， 臧 宇， 薛 頌， 孫 燕， 朱美玲， 梁 碩， 唐學璽??

(1. 中國海洋大學海洋生命學院， 山東 青島 266003； 2. 自然資源部第一海洋研究所， 山東 青島 266061)

自20世紀80年代以來，人類活動釋放的大量消耗臭氧層物質(zhì)(ODS)，如氯氟烴(CFC)、氯烴(CC)、有機溴化物(OB)和一氧化二氮(N2O)等[1]。由于臭氧層被破壞，到達地表的紫外線輻射強度增加了[2]。特別是UV-B(280～315 nm)輻射的增加會影響水生或陸地生態(tài)系統(tǒng)中所有受陽光照射生物的生理和生化過程[3-4]。預計未來60年內(nèi)，到達地表的UV-B輻射強度將會增加2%～40%[5]。UV-B輻射很容易被核酸、脂類和蛋白質(zhì)吸收，導致光氧化反應的發(fā)生[6]，進而在分子、細胞和整個生物體水平上產(chǎn)生多種響應[7]。

雌雄異株植物是生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分。有關(guān)高等植物的雌株和雄株對環(huán)境脅迫的性別差異響應研究已有大量報導[18]。環(huán)境脅迫下，雌雄異株高等植物的生長形態(tài)、生理生化、生殖分配和空間分布存在著性別差異響應[19]。例如：在鹽脅迫下，青楊雄株有更高的滲透調(diào)節(jié)能力、水分利用效率和抗氧化酶活性[20]；銀杏(Ginkgobiloba)[21]、葎草(Humulusscandens)[22]、莧麻(Amaranthuscannabinus)[23]等物種雌株有更高的光合速率、水分利用效率和抗氧化酶活性，并具有更強的抗鹽能力。而目前，針對于具有雌雄異株特性的低等大型海藻展開的研究較少。

鼠尾藻(Sargassumthunbergii)是北太平洋西部特有的暖溫帶海藻，在中國潮間帶地區(qū)均有廣泛分布。鼠尾藻為雌雄異株大型海藻，在某些生物學和生態(tài)學特性方面也已經(jīng)表現(xiàn)出一定的性別差異，例如雌、雄生殖托在形態(tài)上差異較大，通常雄生殖托較為細長，雌生殖托較為粗短[24-25]。同高等植物類似，雌雄異株的大型海藻對外界環(huán)境變化的反應也可能存在不相同的響應特征。由于潮間帶大型海藻隨潮汐變化，周期性地暴露于空氣中，因此與其他海藻相比，潮間帶大型海藻更易受到UV-B輻射增強的影響。因此，本研究分別探索了鼠尾藻雌性和雄性藻體在UV-B輻射增強條件下氧化應激指標的變化,初步揭示了雌雄異株大型海藻在生理水平上對UV-B輻射增強的性別差異響應特征，研究結(jié)果可為準確評估全球變化對雌雄異株大型海藻的影響提供科學數(shù)據(jù)，也進一步豐富了雌雄異株植物的生理生態(tài)學研究內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 實驗材料的采集及培養(yǎng)

2019年7月在青島太平角(36°14′58.3″N，120°21′34.2″E)巖質(zhì)潮間帶的巖質(zhì)上采集實驗所用鼠尾藻雌性和雄性藻體，清除藻體表面附加的沙粒、沉積物、小型食草動物和附生雜藻后用滅菌海水多次洗滌備用。實驗前在大型藻類培養(yǎng)缸((15±0.5) ℃，光合有效輻射(PAR)強度為150 μmol·m-2·s-1，光周期為12L∶12D)中培養(yǎng)14 d。實驗所用的海水與藻類的采集地點相同，過濾后滅菌待用，每2天換1次海水。

1.2 UV-B輻射處理

本實驗采用模擬潮間帶UV-B輻射增強的大型藻類培養(yǎng)輻照體系[26]進行實驗室條件下人工脅迫處理。光源由日光燈管(Philips TL-D，36 W)和UV-B寬頻波段燈管提供(Philips TL 40 W/12 RS)，使用醋酸纖維素薄膜外包，每周更換濾膜一次，以防止濾膜的老化。通過調(diào)整燈管數(shù)量、燈管和藻體間距來調(diào)節(jié)各輻射處理組之間的光照強度。實驗前需連續(xù)照射15 min以上，從而使UV-B輻射體系達到穩(wěn)定狀態(tài)。

市南沿海地區(qū)夏季晴天中午，平均UV-B輻射強度為2.29 W·m-2。為簡化實驗梯度設(shè)計，本實驗將設(shè)置1個對照組和2個處理組，每組分別包含3株雌性藻體和3株雄性藻體，實驗周期為5 d，實驗分組詳見表1。

表1 UV-B輻射處理實驗分組體系設(shè)置

1.3 活性氧含量測定

1.3.2 H2O2含量測定 準確稱取各組藻體組織0.1 g，使用全自動樣品研磨儀進行液氮研磨，加入0.9 mL的PBS緩沖液搖勻， 制備出組織勻漿。放入高速冷凍離心機(GL-20G-Ⅱ)中4 ℃下8 000g離心10 min，使用過氧化氫檢測試劑盒(S0038，碧云天)測定，使用酶標儀在波長560 nm處測定吸光度。

1.4 膜脂過氧化程度測定

脂質(zhì)過氧化以TBA反應物質(zhì)含量為檢測指標，根據(jù)Heath和Packer的方法進行改進[27]。準確稱取各組藻體組織0.1 g，使用全自動樣品研磨儀進行液氮研磨，然后加入1 mL的5% (w/v) TCA。搖勻后，于4 ℃下，12 000g離心10 min，收集上清液，用于檢測TBA和蛋白質(zhì)含量。取100 μL上清液,利用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量[28]。取0.5 mL上清液和2 mL硫代巴比妥酸(5%溶解于20%TCA中)，95 ℃水浴加熱30 min，取出后室溫放置20 min。用分光光度計(U-8000)分別在532和600 nm處測定吸光度，消光系數(shù)為155 mmol-1·L·cm-1。

1.5 主要抗氧化酶活性測定

采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性，操作步驟按使用說明書進行，利用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量[28]。

1.6 AsA-GSH循環(huán)相關(guān)的酶活性測定

采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性，采用索萊寶科技有限公司研制的試劑盒測定單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHA)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHA)活性，操作步驟按使用說明書進行，利用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量[28]。

1.7 AsA-GSH循環(huán)相關(guān)的物質(zhì)含量測定

采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)、氧化性谷胱甘肽(GSSG)含量，采用索萊寶科技有限公司研制的試劑盒測定脫氫抗壞血酸(DHA)含量，操作步驟按使用說明書進行。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

所有實驗結(jié)果均由3個生物學重復實驗得到，各組指標的變化均以平均值±標準差(mean±SD)表示。采用IBM SPSS 22.0軟件的單因素方差分析(One-way ANOVA)中的多重比較(LSD-t檢驗)對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯著性差異水平設(shè)置為0.05(P<0.05)，使用Sigmaplot 14.0繪圖軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠尾藻雌、雄藻體活性氧含量的變化

圖1 UV-B輻射處理5 d后鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)活性氧含量的變化

2.2 鼠尾藻雌、雄藻體膜脂過氧化程度的變化

UV-B輻射強度的增加可以導致鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)細胞膜脂過氧化程度加劇，產(chǎn)生大量丙二醛(MDA)(見圖2)，低強度處理組中的雌性藻體MDA含量顯著高于雄性藻體(P<0.05)，高強度處理組中鼠尾藻雌性藻體MDA含量極顯著高于雄性藻體(P<0.01)。以上結(jié)果表明，UV-B輻射增強條件下，鼠尾藻雌性藻體的膜脂過氧化程度顯著高于雄性藻體(P<0.05)。

圖2 UV-B輻射處理5 d后鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)MDA含量的變化

2.3 鼠尾藻雌、雄藻體主要抗氧化酶活性的變化

鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的SOD活性隨UV-B輻射增強呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(見圖3)，鼠尾藻雄性藻體內(nèi)的SOD活性顯著高于雌性藻體(P<0.05)。鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的CAT活性隨UV-B輻射增強呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(P<0.05)。2.5 W·m-2UV-B輻射組中鼠尾藻雌性藻體的CAT活性顯著高于雄性藻體(P<0.05)。以上結(jié)果表明，UV-B輻射增強條件下，鼠尾藻雄性藻體和雌性藻體的SOD和CAT酶活性具有明顯的性別差異性。

圖3 UV-B輻射處理5 d后鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)主要抗氧化酶活性的變化Fig.3 Changes of major antioxidant enzyme activities in the female and male of S. thunbergii after UV-B radiation treatment for 5 days

2.4 鼠尾藻雌、雄藻體AsA-GSH循環(huán)相關(guān)酶活性的變化

UV-B輻射處理使鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的AsA-GSH循環(huán)相關(guān)酶的活性上調(diào)(見圖4)。UV-B輻射增強，鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的APX和GPX活性均顯著上升(P<0.05)，2.5 W·m-2輻射組中鼠尾藻雌性藻體的APX和GPX活性均顯著高于雄性藻體(P<0.05)。與對照組比較，隨UV-B輻射增強，鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的GR活性呈現(xiàn)上升趨勢，鼠尾藻雌、雄藻體之間的GR活性差異并不顯著(P>0.05)。鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的DHAR活性隨UV-B輻射增強呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(P<0.05)，且雄性藻體的DHAR活性均顯著高于雌性藻體(P<0.05)。UV-B輻射增強，鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的MDHAR活性顯著上升(P<0.05)，雌性藻體的MDHAR活性均顯著高于雄性藻體(P<0.05)。

圖4 UV-B輻射處理5 d后鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)AsA-GSH循環(huán)相關(guān)酶活性的變化Fig.4 Changes of AsA-GSH cycle related enzyme activities in the female and male of S. thunbergii after UV-B radiation treatment for 5 days

2.5 鼠尾藻雌、雄藻體AsA-GSH循環(huán)相關(guān)物質(zhì)含量的變化

UV-B輻射處理下，鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)大多數(shù)AsA-GSH循環(huán)相關(guān)抗氧化劑的含量上升(見圖5)。UV-B輻射增強，鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的AsA含量先顯著上升(P<0.05)，后下降，各處理組均高于對照組。2.5 W·m-2輻射組中鼠尾藻雌性藻體的AsA含量顯著高于雄性藻體(P<0.05)。與對照組比較，隨UV-B輻射增強，鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的DHA含量呈現(xiàn)下降趨勢，2.5 W·m-2輻射組中鼠尾藻雌性藻體的DHA含量顯著高于雄性藻體(P<0.05)，鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的AsA/DHA比率呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(P<0.05),所有輻射處理組中鼠尾藻雌、雄藻體的AsA/DHA比率均不存在顯著性別差異(P>0.05)。鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的GSH含量隨UV-B輻射增強也呈現(xiàn)顯著先上升(P<0.05)后下降的趨勢，但均高于對照組。2.5 W·m-2UV-B輻射組中鼠尾藻雌性藻體的GSH含量顯著高于雄性藻體(P<0.05)。UV-B輻射增強可以導致鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的GSSG含量上升且雌性藻體的GSSG含量高于雄性藻體(P>0.05)。UV-B輻射增強，鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的GSH/GSSG比率呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(P<0.05)，鼠尾藻雌、雄藻體的GSH/GSSG比率不存在顯著性別差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明，UV-B脅迫處理下，鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)的AsA、DHA和GSH的含量變化皆存在性別差異性響應，雌性藻體中AsA、DHA和GSH的含量顯著高于雄性(P<0.05)，GSSG含量和AsA/DHA、GSH/GSSG比率變化雖存在差異但不顯著(P>0.05)。

圖5 UV-B輻射處理5 d后鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)AsA-GSH循環(huán)相關(guān)物質(zhì)含量和比率的變化Fig.5 Changes of contents and ratio of substances related to AsA-GSH cycle in the female and male of S. thunbergii after UV-B radiation treatment for 5 days

3 討論

在植物的活性氧清除系統(tǒng)中，AsA-GSH循環(huán)對清除環(huán)境脅迫下產(chǎn)生的ROS有重要作用[38]。其主要存在于藻類的葉綠體中，GSH通過促進AsA的合成來清除光反應中產(chǎn)生過量的H2O2[39]，是光合器官中重要的H2O2代謝途徑[40]。APX氧化AsA清除H2O2形成DHA，通過DHAR從GSH中獲取電子，再還原為AsA，這些反應的產(chǎn)物GSSG被GR的活性和NADPH的消耗所還原[41]。已有研究證明，在UV-B脅迫下，AsA-GSH循環(huán)的關(guān)鍵酶APX和GR的轉(zhuǎn)錄水平升高，從而起到活性氧清除作用[42-43]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中也發(fā)現(xiàn)了UV-B可提高APX、MDHAR和GR的活性，APX活性并不隨DHAR活性的增加而增加，DHAR活性也不隨APX活性的增加而增加，UV-B輻射脅迫下擬南芥(A.thaliana)傾向于誘導APX活性而不是DHAR活性[44]。

大型海藻裂片石莼(Ulvafasciata)在低UV-B輻射強度下，AsA-GSH循環(huán)水平提高，DHAR、MDHAR和GR活性增加促進AsA和GSH的再生能力提高，起到了維持細胞H2O2平衡的作用，中、高強度UV-B輻射下，AsA-GSH循環(huán)受到抑制[45]。

本研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，UV-B輻射增強條件下，鼠尾藻雌、雄藻體通過提高AsA-GSH循環(huán)內(nèi)的APX、GR、DHAR和MDHAR活性，促進體內(nèi)AsA、DHA、GSH和GSSG之間的相互轉(zhuǎn)化，增加了AsA/DHA和GSH/GSSG比例，提高了AsA和GSH的再生能力，對積累的H2O2進行清除，從而減輕UV-B輻射對藻體的氧化損傷。此循環(huán)中雌藻的大多數(shù)抗氧化酶活性和抗氧化劑含量高于雄藻，雌性藻體內(nèi)的H2O2含量低于雄性藻體，說明鼠尾藻雌性藻體和雄性藻體間的活性氧清除能力存在差異。對高等植物青楊(Populuscathayana)雌、雄株在UV-B輻射脅迫下性別的差異變化研究與本研究結(jié)果一致，因而認為雄性比雌性具有更有效的抗氧化系統(tǒng)來緩解UV-B脅迫壓力[46]，表明雄性可能比雌性具有更強的UV-B抗性。與低強度處理組比較，高強度處理組下鼠尾藻雌、雄藻體AsA和GSH含量下降，說明了AsA-GSH循環(huán)受到一定抑制，活性氧的清除效率受到限制，因此活性氧含量持續(xù)增加。鼠尾藻雌、雄藻體內(nèi)GSH和AsA含量呈現(xiàn)同樣變化，GSH促進了AsA的合成。AsA/DHA和GSH/GSSG的高比值表明，鼠尾藻雌、雄藻體均有DHA向AsA、GSSG向GSH快速再生的能力，雌藻與雄藻之間的AsA和GSH再生能力沒有性別差異性。

4 結(jié)語

本文對鼠尾藻雌、雄藻體分別進行了實驗室條件下的UV-B輻射處理，研究了鼠尾藻在UV-B輻射增強條件下，活性氧清除系統(tǒng)的性別差異響應特征。UV-B輻射增強條件下，鼠尾藻雌、雄藻體的活性氧清除系統(tǒng)都發(fā)揮了保護作用，雌性藻體的H2O2含量低于雄性藻體，所測得的多數(shù)抗氧化酶活性和抗氧化劑含量高于雄性藻體，表明在UV-B輻射增強條件下，雌性藻體的活性氧清除能力高于雄性藻體。