蔣玉清，李文平，左巖

黃芪注射液對大鼠扭轉(zhuǎn)復(fù)位后睪丸組織的保護(hù)作用

蔣玉清1，李文平1，左巖2

目的：探討黃芪注射液對雄性Wistar大鼠扭轉(zhuǎn)復(fù)位后睪丸的保護(hù)作用。方法：30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）、睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位組（B組）、黃芪注射液治療組（C組），每組10只，Turner法建立單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型，原位缺口末端標(biāo)記法檢測各組睪丸組織中生殖細(xì)胞凋亡，化學(xué)比色法測定超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量。結(jié)果：黃芪注射液治療組與睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位組比較，SOD含量明顯升高，MDA含量明顯降低，生精細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低。睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位組、黃芪注射液治療組與假手術(shù)對照組比較，SOD含量明顯降低，MDA含量明顯升高，生精細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高。結(jié)論：黃芪注射液可減少大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后睪丸組織的雙側(cè)睪丸生殖細(xì)胞凋亡，對扭轉(zhuǎn)復(fù)位后睪丸生殖細(xì)胞有保護(hù)作用。其機(jī)理可能與提高抗氧化酶活性及減少氧自由基的產(chǎn)生從而減輕大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后的缺血再灌注損傷有關(guān)。

睪丸扭轉(zhuǎn)；黃芪注射液；缺血再灌注損傷；凋亡

睪丸扭轉(zhuǎn)是泌尿外科急癥，需行睪丸早期復(fù)位，常出現(xiàn)不同程度的睪丸萎縮乃至生精功能低下。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位動物模型，探討黃芪注射液對Wistar雄性大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物選擇健康成年（6～8周）雄性Wistar大鼠30只（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)0905012），體重150～200 g，同等條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食。

1.2 主要試劑和藥物SOD試劑盒，南京建成生物工程研究所；MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；凋亡試劑盒，羅氏公司。黃芪注射液，每支10 mL（相當(dāng)于原藥材20 g），國藥準(zhǔn)字Z51021776批號0608037，成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn)。

1.3 分組30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）、睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位組（B組）、黃芪注射液治療組（C組），每組10只。

1.4 動物模型建立采用Turner法[1]:2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。A組:左側(cè)陰囊切開，游離暴露睪丸，依扭轉(zhuǎn)模型隨意搬動，但不予扭轉(zhuǎn)。B組：左側(cè)睪丸順時(shí)針繞精索旋轉(zhuǎn)720?，肉膜白膜縫合固定，以防止自動復(fù)位。扭轉(zhuǎn)6 h后復(fù)位固定。C組：方法同B組，于扭轉(zhuǎn)復(fù)位前30 min（即扭轉(zhuǎn)后5.5 h）腹腔注射黃芪注射液（3 g/kg），再于術(shù)后第1、2、3 d分別腹腔注射黃芪注射液1次（1 g/(kg·d))。

1.5 標(biāo)本采集和組織勻漿的制備術(shù)后7 d,用快速脫頸椎法處死所有大鼠，取雙側(cè)睪丸標(biāo)本，分別留取組織勻漿和石蠟切片的標(biāo)本。標(biāo)本檢測均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 SOD含量扭轉(zhuǎn)側(cè)：C組與B組比較明顯升高，差異有顯著性(P＜0.001)；B組、C組與A組比較均明顯降低，差異均有顯著性(分別為P＜0.001，P＜0.05)。

對側(cè)：C組與B組比較明顯升高，差異有顯著性（P＜0.001)；B、C組與A對照組比較均明顯降低，差異均有顯著性(分別為P＜0.001，P＜0.05)。

2.2 MDA含量扭轉(zhuǎn)側(cè)：C組與B組比較明顯降低，差異有顯著性(P=0.000)；B組、C組與A組比較均明顯升高，差異均有顯著性(分別為P＜0.001，P＜0.05)。

對側(cè)：C組與B組比較明顯降低，差異有顯著性(P＜0.001)；B組、C組與A組比較均明顯升高，差異均有顯著性(分別為P＜0.001，P＜0.05)。

2.3 細(xì)胞凋亡鏡下凋亡細(xì)胞核染呈棕褐色，正常細(xì)胞核染成藍(lán)紫色（圖1）。A組扭轉(zhuǎn)側(cè)及對側(cè)睪丸僅見散在分布的生精細(xì)胞凋亡。與假手術(shù)組比較，B組扭轉(zhuǎn)側(cè)睪丸生精細(xì)胞排列紊亂，部分生精細(xì)胞脫落、胞漿濃縮，間質(zhì)充血、水腫，生殖細(xì)胞AI較假手術(shù)組明顯增高(P＜0.001)，發(fā)生凋亡細(xì)胞主要為降解的各級生精細(xì)胞，尤其是初級精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞未見凋亡（圖2）；對側(cè)睪丸生精細(xì)胞AI較假手術(shù)組明顯增加(P＜0.001)。C組扭轉(zhuǎn)側(cè)睪丸精曲小管結(jié)構(gòu)完整，僅見少數(shù)生精細(xì)胞脫落，間質(zhì)未見明顯變化（圖3），生精細(xì)胞AI較B組明顯減少差異有顯著性(P＜0.001)；對側(cè)睪丸僅見散在分布的生精細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡較B組差異有顯著性差異(P＜0.001)，較假手術(shù)組有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

表1 各組間SOD、MDA和AI的比較(

表1 各組間SOD、MDA和AI的比較(

注：與假手術(shù)組比較，▲P＜0.001，與扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型組比較，*P＜0.05

組別假手術(shù)組假扭轉(zhuǎn)側(cè)對側(cè)扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型組扭轉(zhuǎn)側(cè)對側(cè)黃芪注射液治療組扭轉(zhuǎn)側(cè)右側(cè)n SOD(u∕mg)MDA(nmol∕mg)AI(%) 10 293.03±23.42 295.66±25.43 1.43±0.17 1.27±0.15 5.82±1.21 5.65±1.42 10 220.78±24.66▲241.19±14.20▲3.98±0.36▲2.11±0.27▲36.18±8.40▲12.95±3.06▲10 11.61±5.12*7.56±1.06*271.06±21.17*276.43±15.04*2.57±0.53*1.58±0.29*

3 討論

臨床上單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)即使未發(fā)生組織梗死，復(fù)位后血供雖然恢復(fù)正常,仍會導(dǎo)致睪丸損傷。單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)造成組織急性缺血，復(fù)位則為再灌注損傷提供了病理基礎(chǔ)，如同心臟、皮瓣等缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，IR)一樣，睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位也是一個(gè)IR過程，其損傷本質(zhì)是IR損傷。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞分化過程中受到一系列基因調(diào)控而發(fā)生的一種主動、自發(fā)性的細(xì)胞死亡過程，其需要凋亡信號的啟動及相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。Turner TT等［2］將大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)1 h后復(fù)位，再灌注4 h，睪丸組織白細(xì)胞遷徙和浸潤明顯增多、脂質(zhì)過氧化物增高，隨著再灌注時(shí)間延長(4～48 h)，生精細(xì)胞凋亡也隨之增加。顯示睪丸IR損傷在睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位生精細(xì)胞凋亡增加中起關(guān)鍵性作用。在睪丸IR過程中，睪丸被膜下小靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞黏附分子，促使白細(xì)胞主要是多形核白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮，進(jìn)而穿透上皮浸潤睪丸間質(zhì)釋放大量活性氧。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)6 h復(fù)位，1周后觀察，扭轉(zhuǎn)側(cè)睪丸生精細(xì)胞凋亡明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精細(xì)胞凋亡增加是睪丸損害的病理基礎(chǔ)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后，另側(cè)睪丸生精細(xì)胞凋亡也明顯增加，證實(shí)單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后對側(cè)生精細(xì)胞凋亡增加是也對側(cè)睪丸損害的病理機(jī)制。

圖1 正常睪丸生殖細(xì)胞凋亡（×400）

圖2 扭轉(zhuǎn)組睪丸生殖細(xì)胞凋亡（×200）

圖3 黃芪注射液治療組睪丸生殖細(xì)胞凋亡（×200）

扭轉(zhuǎn)一側(cè)睪丸除了造成患側(cè)組織的直接損傷以外，還會導(dǎo)致對側(cè)睪丸的交感性損傷。血流監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，一側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)后，對側(cè)睪丸的血流速度也相應(yīng)減緩，這是非扭轉(zhuǎn)側(cè)睪丸受到缺血損害的原因之一。扭轉(zhuǎn)睪丸復(fù)位以后，隨著患側(cè)血流再灌注，對側(cè)血流速度也相應(yīng)恢復(fù)。測定睪丸扭轉(zhuǎn)以后局部產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物含量，也證明了這一現(xiàn)象，說明睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位所引起的睪丸血流供應(yīng)情況的變化可能是對側(cè)睪丸損傷的機(jī)制之一。

黃芪為多年生草本植物。根味甘，微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾利濕等功效，用于治療氣虛、血虛、血瘀之證。研究表明黃芪中的有效成分黃酮、皂甙、多糖具有清除自由基，抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用；黃芪尚能調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝［3］。研究表明［4］，黃芪具有顯著的抗氧化活性，能抑制氧自由基的產(chǎn)生和清除體內(nèi)過多的氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的影響，還可以提高抗氧化酶及抗氧化劑的含量和活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Wistar大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)所致的缺血再灌注損傷，應(yīng)用黃芪注射液后，睪丸組織中SOD活性升高，MDA含量降低，生精細(xì)胞凋亡指數(shù)較單純扭住復(fù)位未使用黃芪注射液組低，且黃芪連續(xù)使用組該變化更為明顯。提示黃芪對Wistar大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)所致的缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是藥物能減輕睪丸組織細(xì)胞缺血缺氧，降低睪丸缺血再灌注所致的過氧化脂質(zhì)的增高，提高清除氧自由基的超氧化物歧化酶的活性，從而減少了睪丸組織細(xì)胞的凋亡。

本研究表明，黃芪注射液對大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后缺血再灌注損傷確有一定的保護(hù)作用，但其分子機(jī)制尚不清楚。另外，其最佳用藥劑量、途徑及給藥時(shí)間也需進(jìn)一步摸索。

[1]嚴(yán)彬，牛茜，南曉東，等.黃芪注射液對大鼠腎缺血再灌注損傷的影響[J].醫(yī)學(xué)導(dǎo)報(bào),2003,25(1):10.

[2]Tuner TT,Tung Kenneth SK,Tomomasa H,et al.Acute testicular ischemia result in germ cell-specific apoptosis in the rat[J].Biol Report,1997,57(6):1267.

[3]蘇南湘，祖雄兵.黃芪對缺血再灌注損傷保護(hù)作用機(jī)制研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2004,14（8）:142.

[4]Willgoss DA，Zhang B,Gobe GC,et al.Repetitive brief ischemia intermittent reperfusion during ischemia ameliorates the extent of injury in the perfused kidney[J].Ren Fail,2003,25(3):379.

（收稿：2010-02-06修回：2010-05-20）

（責(zé)任編輯劉洪斌田在善）

Protective Effect of Astragalus Membranaceus Injection on Testis Following Testicular Torsion/detor?sion in Rats.

Jiang Yuqing,Li Wenping,Zuo Yan.Department of Urologic Surgery,The Third Affiliated Hospi?

tal of Hebei Mdical University,Shijiazhuang(050051),China

ObjectiveTo investigate the protective effect of astragalus membranaceus injection on testis fol?lowing testicular torsion∕detorsion in rats.MethodsThirty Wistar rats were randomly divided into testicular torsion sham control group(group A),testicular torsion∕detorsion group(Group B),testicular torsion detorsion and single astragalus injection treatment group(group C),10 in each group.The unilateral testicular torsion∕de?torsion model was established according to Turner method.Paraffin-embedded sections of testicular tissue were measured in TdT-mediated d-UTP nick end labeling(TUNEL)method to investigate germ cell apoptosis.Deter?mination of the chemical testicular tissue was to investigate superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde (MDA).Results1 Single astragalus injection treatment group was compared with testicular torsion∕detorsion group:SOD levels significantly increased,the content of MDA was reduced drastically.Apoptosis index was sig?nificantly reduced.2 Astragalus injection treatment group was compared with testicular torsion∕detorsion group: SOD levels were significantly higher,the content of MDA was significantly reduced drastically.Apoptosis index was significantly lower.Conclusion1 Astragalus injection can reduce the bilateral germ cell reduction and thus to protect the testicular germ cell after testicular torsion∕detorsion.2 Astragalus injection may improve anti?oxidant enzyme activity and reduce the production of oxygen-derived free radicals so as to reduce rat testicular ischemia-reperfusion injury after testicular torsion∕detorsion.

testicular torsion，astragalus，ischemia-reperfusion injury，apoptosis

R285.5；R697+.22

A

1007-6948(2010)04-0445-03

10.3969∕j.issn.1007-6948.2010.04.017

1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科(石家莊050051)

2.石家莊市第三醫(yī)院(石家莊050000)

蔣玉清，Tel：13930161790，E-mail：zzqjyq@yahoo.cn