高明春，李雪萌，張潤(rùn)祥，王君偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）是一類非特異性磷酸單酯酶，可催化磷酸單酯的水解[1]。AP廣泛存在于多種細(xì)菌、真菌及動(dòng)物中。不同來(lái)源AP的分子質(zhì)量大小、編碼序列差異很大，而且各物種AP的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能與催化機(jī)理也不盡相同[2-3]。在這其中，大腸桿菌AP（Escherichia coli alkaline phosphatase，EAP）的有關(guān)研究最為透徹。EAP由ρhoA基因編碼，為同源二聚體金屬酶，單體由449個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為47 ku，活性中心包括3個(gè)金屬離子[4]。因EAP催化機(jī)理明晰，底物范圍廣泛，目前被作為信號(hào)酶而廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)和分析生物技術(shù)領(lǐng)域[5-6]。大腸桿菌ATCC 25922無(wú)致病性和耐藥基因，在生物研究領(lǐng)域通常將其作為對(duì)照用標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌模式菌株[7-9]，但ATCC 25922 EAP的研究未見(jiàn)報(bào)道，其分子序列與酶活性等均屬未知，本研究克隆并表達(dá)了來(lái)自大腸桿菌菌株ATCC 25922的EAP成熟肽基因，并對(duì)其進(jìn)行了純化以及功能研究，以期為ATCC 25922 EAP的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和試劑

大腸桿菌菌株E.coli ATCC 25922、克隆宿主菌TG1為本室（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物與免疫教研室）保存；純品GoIFN-γ-ScFv-EAP蛋白（即EAP N端融合有抗鵝γ干擾素單鏈抗體的重組蛋白）本室制備并保存；表達(dá)宿主菌RosettaTM（DE3）pLysS、原核表達(dá)載體 pET-30a（+）購(gòu)自Novagen公司；pMD18-T-simple、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素、堿性磷酸酶底物對(duì)硝基苯磷酸（pNPP）購(gòu)自美國(guó)Amresco公司。

1.1.2 引物

參照E.coli K12的ρhoA基因序列（Accession NO.CP000948.1），使用Primer Premier5設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增EAP成熟肽基因的引物，即EAP1 5'GCAGGATCCCGGACACCAGAAATG 3'與EAP2 5'GAGCCTCGAGTTATTTCAGCCCCAGA 3'，分別帶有Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2 方法

1.2.1 EAP的克隆

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)操作，提取ATCC 25922基因組，并以此為模板，克隆EAP基因。PCR產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。純化回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T-simple載體連接后轉(zhuǎn)化入TG1，在Amp平板上挑選單菌落活化后提取質(zhì)粒，酶切及PCR鑒定正確后，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序服務(wù)。

重組表達(dá)載體pET-30a-EAP的構(gòu)建及鑒定參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，將連接在T載體上的EAP基因以Bam HⅠ、XhoⅠ消化下來(lái)并回收純化，與相同酶切回收的pET-30a連接，轉(zhuǎn)化TG1后涂布Kan抗性平板進(jìn)行篩選，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切及PCR鑒定。

1.2.2 EAP基因表達(dá)與可溶性分析

將鑒定正確的pET-30a-EAP轉(zhuǎn)化入Rosetta（DE3），按1%的比例接種陽(yáng)性菌液至含有200 mL LB的培養(yǎng)瓶，然后置于30℃220 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，在菌液OD600約為0.4時(shí)加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。取1 mL誘導(dǎo)后的菌液離心后進(jìn)行SDS-PAGE分析。另取10 mL菌液離心、超聲波處理后上清液用于蛋白可溶性分析。剩余菌液離心后將濕菌儲(chǔ)存于-70℃冰箱備用。

1.2.3 rEAP純化流程

取前一步誘導(dǎo)后的濕菌重懸于20 mL的NPB緩 沖 液（Native purification buffer， 50 mmol·L-1NaH2PO4，300 mmol·L-1NaCl），4℃5 000 r·min-1離心15 min后再重懸于12 mL NPB，反復(fù)凍融3次后在冰浴環(huán)境中超聲破碎菌體，8 000 r·min-115 min離心后，上清組分用于可溶性rEAP蛋白純化。將細(xì)菌裂解液上清7 mL過(guò)濾后加入柱式Ni-NTA純化系統(tǒng)（Invitrogen，1 mL填料），采用說(shuō)明書(shū)所載的正常條件下的pH梯度洗脫方式并稍作改進(jìn)對(duì)可溶性rEAP進(jìn)行純化。菌體裂解液與Ni-NTA作用1 h后，以Buffer A～D（即將NPB pH分別調(diào)至8.0、7.2、6.6和5.3）進(jìn)行洗滌，每次2 mL，每種溶液各洗滌 2 次；Buffer E～G（100 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1KCl，pH 分別為 4.2、3.7、3.3和3.0）進(jìn)行洗脫，每次1 mL，每種溶液洗脫3次；最后用4 mL的0.01 mol·L-1NaOH洗柱2次，每次2 mL。對(duì)各級(jí)洗滌與洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析，并用Bradford法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。

1.2.4 rEAP酶促反應(yīng)特性

1.2.4.1 濃度對(duì)rEAP催化速率的影響

取空白酶標(biāo)板一塊，室溫下每孔添加pNPP顯色底物溶液（50 mg·L-1pNPP，1 mmol·L-1MgCl2溶于0.1 mol·L-1二乙醇胺緩沖液（pH 9.8））50 μL，然后分別按以下體積添加純化的rEAP：0、32、16、8、4、2、1、0.5 μL，去離子水將每孔補(bǔ)齊至 100 μL。室溫反應(yīng)20 min后，每孔添加 50 μL 3 mol·L-1NaOH終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀測(cè)定此時(shí)的OD405nm。

1.2.4.2 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將EAP置于100℃水浴10 min，恢復(fù)室溫后靜置30 min，再按1.2.4.1條件進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.4.3 rEAP N端定向標(biāo)記多肽的酶促反應(yīng)

純品GoIFN-γ-ScFv-EAP蛋白，按物質(zhì)的量濃度折算為與1.2.4.1中EAP相當(dāng)?shù)臐舛龋M(jìn)行pNPP顯色反應(yīng)，評(píng)估N端融合多肽對(duì)ATCC 25922 EAP催化能力的影響。

1.2.4.4 溫度對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力的影響

將1.2.4.1的反應(yīng)溫度分別改為25、37、50、56和65℃，其他條件不變進(jìn)行顯色試驗(yàn)。1.2.5 DNA去磷酸化試驗(yàn)

從瓊脂糖凝膠回收Bam HⅠ酶切后的pET-30a（+）載體，分別用或不用 rEAP（0.35 mg·mL-1）去磷酸化，并轉(zhuǎn)化入100 μL TG1。計(jì)數(shù)平板上菌落數(shù)，以評(píng)估rEAP對(duì)DNA去磷酸化的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌菌株ATCC 25922 EAP成熟肽基因的克隆與鑒定

EAP成熟肽基因克隆入pMD18-T-simple載體后，酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示。pMD18-T-simple-EAP經(jīng)XhoⅠ單酶切，片段長(zhǎng)為4.1 kb。該載體經(jīng)XhoⅠ、Bam HⅠ雙酶切，得到1.4和2.7 kb兩個(gè)片段。測(cè)序結(jié)果表明克隆的該基因?yàn)锳TCC 25922株大腸桿菌EAP成熟肽基因。

2.2 表達(dá)載體pET-30a-EAP的酶切與PCR鑒定

表達(dá)載體pET-30a-EAP經(jīng)XhoⅠ或Bam HⅠ單酶切后得6.8 kb的片段，XhoⅠ和Bam HⅠ雙酶切后，得到5.4和1.4 kb兩個(gè)片段。PCR產(chǎn)物應(yīng)出現(xiàn)1.4 kb左右片段。如圖2所示，電泳結(jié)果與預(yù)期相符。

圖1 酶切鑒定pMD18-T-EAPFig.1 Identification of pMD18-T-EAP with restriction enzyme

圖2 pET-30a-EAP的酶切及PCR鑒定Fig.2 Identification pET-30a-EAP with restriction and PCR

2.3 EAP蛋白的可溶性分析

如圖3所示，重組菌IPTG誘導(dǎo)后在預(yù)期位置可觀測(cè)到明顯的蛋白表達(dá)條帶，而對(duì)照菌卻沒(méi)有。重組EAP的表達(dá)量在28%左右，并且絕大部分產(chǎn)物為可溶性表達(dá)。

圖3 EAP蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.3 Detecting EAP expressed product with SDS-PAGE

2.4 rEAP蛋白純化工藝研究

對(duì)可溶性rEAP進(jìn)行pH梯度洗脫法的金屬親合層析純化，結(jié)果如圖4所示。pH低于4.2時(shí)，EAP開(kāi)始與親合基質(zhì)解離，此時(shí)某些雜質(zhì)蛋白也被洗脫，至pH 3.7之后的組份較為純凈，光密度掃描分析表明純度均在93%之上。按此方法純化，每升培養(yǎng)物可獲得290 mg純品rEAP，回收率為40%。

2.5 EAP活性分析

2.5.1 rEAP、EAP標(biāo)記蛋白的反應(yīng)速率及熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

rEAP可催化對(duì)硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate，pNPP）產(chǎn)生黃色對(duì)硝基酚，并且煮沸后重新復(fù)性的rEAP催化特性沒(méi)有明顯改變，而EAP與其他蛋白融合后反應(yīng)性能略有下降（見(jiàn)圖5）。

2.5.2 溫度對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力性質(zhì)的影響

如圖6所示，rEAP在25～65℃之間的催化性能均良好，且隨反應(yīng)溫度升高酶活性顯著升高，65℃時(shí)的活性約為25℃時(shí)的4倍。

2.5.3 rEAP的DNA去磷酸化試驗(yàn)

rEAP處理DNA前后的自連轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖7所示。去磷酸化比未去磷酸化平板的自連轉(zhuǎn)化子數(shù)量顯著減少，表明重組子rEAP具有顯著的移除DNA 5'端游離磷酸基團(tuán)的能力。

圖4 Ni-NTA親和層析純化EAP蛋白Fig.4 Recombinant EAP purification by affinity chromatography

圖5 重組EAP、EAP融合蛋白濃度與反應(yīng)速率及熱穩(wěn)定性試驗(yàn)Fig.5 Concentration,reaction rate and thermal stability test of recombinant EAP and EAP fusion protein

圖6 溫度對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力的影響Fig.6 Effect of temperature on the enzyme kinetics

圖7 重組EAP的DNA去磷酸化試驗(yàn)Fig.7 DNA dephosphorylation test of recombinant EAP

3 討 論

近年，包括大腸桿菌K12在內(nèi)的多株大腸桿菌的EAP基因得到克隆與活性研究[10-13]，而關(guān)于大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922的EAP基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究證實(shí)ATCC 25922 EAP具有典型的EAP酶活性。作為一個(gè)新的EAP成員，ATCC 25922 EAP功能的驗(yàn)證，豐富了人們對(duì)EAP的存在菌株以及催化活性等有關(guān)知識(shí)的進(jìn)一步了解。

大腸桿菌堿性磷酸酶作為工具酶，可在基因連接中介導(dǎo)DNA去磷酸化反應(yīng)。在ELISA等免疫學(xué)檢測(cè)方法中作為信號(hào)分子也有廣泛的應(yīng)用。目前市場(chǎng)常見(jiàn)的AP產(chǎn)品中，CIAP（牛小腸AP）活性最高，約為天然EAP的40倍左右[13]。與提純天然的CIAP相比，EAP具有成本低，熱穩(wěn)定性好，而且可以通過(guò)基因工程方法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的直接、定向標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。并且由于EAP的催化活性與結(jié)構(gòu)關(guān)系明確，可以方便的通過(guò)定點(diǎn)誘變等方法來(lái)提高EAP的酶活性。在后續(xù)研究中，本實(shí)驗(yàn)室擬將催化活性位點(diǎn)101位氨基酸D突變?yōu)镾，及對(duì)其他活性位點(diǎn)進(jìn)行誘變[10-12]，以期獲得更高活性的rEAP。

本研究探索了重組ATCC 25922 EAP的純化工藝，所表達(dá)的rEAP幾乎全部可溶，并且具有典型AP酶活性。通過(guò)摸索金屬親和層析純化rEAP的條件，得到了純度達(dá)93%以上的rEAP，理論上每升LB培養(yǎng)基可得到290 mg的rEAP純品。rEAP的酶熱穩(wěn)定性良好，100℃作用10 min后仍可恢復(fù)完全的酶活性，所耐受的工作溫度范圍也較為寬泛（25～65℃），因而可滿足多種反應(yīng)條件的需求。

本研究還證實(shí)rEAP具有作為標(biāo)記酶或報(bào)告分子的潛力，并且可用于DNA去磷酸化反應(yīng)，為ATCC 25922 rEAP作為免疫酶與信號(hào)酶的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了必要參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究克隆并高效表達(dá)了E.coli ATCC 25922 EAP，初步探索了重組EAP的純化工藝、酶活特性及應(yīng)用方向，為ATCC 25922 EAP的后繼開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定了必要的基礎(chǔ)。

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