高 召，任志龍，丁國(guó)華，梁 偉，楊紅霞(武漢大學(xué)人民醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430060)

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)在糖尿病腎病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，阻斷RAS成為目前治療糖尿病腎病的重要措施[1-3]。然而臨床上作用于RAS的藥物會(huì)引起血漿腎素水平升高，減弱治療效果[4]。近年來(lái)腎素及腎素受體成為研究的熱點(diǎn)，人們希望通過(guò)此靶點(diǎn)從源頭阻斷RAS以獲得更佳療效。目前，有關(guān)糖尿病模型腎臟中腎素和腎素受體表達(dá)水平的研究較少。為了進(jìn)一步研究糖尿病模型腎素與腎素受體表達(dá)變化與糖尿病腎病之間的聯(lián)系，本研究擬通過(guò)建立鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)糖尿病大鼠模型，觀察糖尿病大鼠腎臟腎素及腎素受體表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 STZ(Sigma);多克隆兔抗大鼠腎素/腎素抗體(renin/renin receptor antibody，Santa Cruz公司);SP免疫組化染色試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);濃縮型DAB試劑盒(北京中杉公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋坊上海生物科技有限公司);PCR試劑盒(Fermentas)、renin/renin receptor引物和β-actin引物(上海英駿);DNA M arker(SABC公司);BCA試劑盒(Pierce);125I血管緊張素Ⅰ放射免疫分析試劑盒(北京科美東雅生物技術(shù)有限公司);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司);BX51顯微攝像系統(tǒng)(Olympus);PCR儀(T-personal，Biometra);ZF-258全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 糖尿病大鼠模型建立 12只體質(zhì)量180～220 g的SPF級(jí)雄性Wistar大鼠(湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(N組)6只和模型組(DM組)6只。DM組禁食36 h后在大鼠左下腹腔注射STZ 60 mg/kg。N組腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。DM組于72 h后尾靜脈取血測(cè)定血糖，以血糖大于或等于16.7 mmol/L，確定為糖尿病大鼠。未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者，重復(fù)上述方法、劑量，至模型成功[5]。實(shí)驗(yàn)期間兩組均自由飲食。

1.3 標(biāo)本采集與檢測(cè) 造模成功后第 4周、8周收集24 h尿液檢測(cè)尿總蛋白和尿肌酐;8周后乙醚麻醉動(dòng)物，心臟采血，檢測(cè)血糖、血肌酐(SCr)、血鈉(Na)、血鉀(K)。腎臟常規(guī)石蠟包埋，切片，用于PAS染色及免疫組化。血糖、肌酐、血鈉(Na)、血鉀(K)由Beckman自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。免疫透射比濁法檢測(cè)尿蛋白(上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司)。

1.4 腎組織病理學(xué)分析 腎組織石蠟切片(2～3μ m)常規(guī)脫蠟入水，行PAS染色，普通光鏡下觀察腎組織病理改變[6]。腎小球損傷程度采用腎小球損傷指數(shù)進(jìn)行半定量分析，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:病變范圍未見(jiàn)明顯改變計(jì)0分，病變范圍占腎小球面積小于25%計(jì)1分，25%～50%之間計(jì)2分，50%～75%之間計(jì)3分，大于75%計(jì)4分。每張切片200倍鏡下觀察50個(gè)正切腎小球，腎小球損傷指數(shù)計(jì)算公式為:1×N1+2×N2+3×N3+4×N4，式中N1代表1分的損害腎小球個(gè)數(shù)，…，N4為代表4分的損害腎小球個(gè)數(shù)。

1.5 免疫組化法檢測(cè)腎素及腎素受體表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，檸檬酸緩沖液(pH 6.0)微波修復(fù)，3%H2O2阻斷，5%BSA封閉，加一抗(兔腎素和腎素受體多克隆抗體，santa cruz公司)4℃過(guò)夜，滴加二抗IgG及SP復(fù)合物，DAB顯色，蘇木素復(fù)染鹽酸分化，脫水，封片。以PBS代替一抗設(shè)置陰性對(duì)照，以細(xì)胞漿棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片400倍鏡下隨機(jī)攝取20個(gè)腎小球，采用Image-pro plus6.0軟件分析，以腎小球切面腎素和腎素受體積分光密度(IOD)表示陽(yáng)性物質(zhì)的相對(duì)含量。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)腎素/腎素受體mRNA表達(dá) 取100 mg腎組織加入T rizol試劑1 mL，參照說(shuō)明書提取總RNA。2μg RNA在 20μ L逆轉(zhuǎn)錄體系中擴(kuò)增合成cDNA。模板進(jìn)行腎素及腎素受體PCR擴(kuò)增反應(yīng)，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。腎素上游引物:5′GAG TCA TCC CTG TCT TCG 3′;下游引物:5′GTG TCC ACC ACT GCC ATA 3′。產(chǎn)物為256 bp。腎素受體上游引物:5′GGG AAG CGT TAT GGAG 3′;下游引物:5′CGC AAG GTT GTA GGGA 3′。產(chǎn)物為219 bp。用β-actin作為內(nèi)參，其上游引物為:5′AGC CAT GTA CGT AGC CAT CC 3′;下游引物為:5′TCT CAG CTG TGG TGG TGA AG 3′，產(chǎn)物為 220 bp。PCR反應(yīng)體系 25μ L:cDNA 1μ L，上下游引物1μ L，2 ×PCR mix 12.5μ L，去核酸水9.5μ L。擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94 ℃3 min，變性94℃45 s，退火溫度:腎素54.1℃45 s、腎素受體50.1℃45 s，延伸72℃45 s，循環(huán)35次，72℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，ZF-258全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行攝影并采用Gel-pro Analyzer version 4.5行半定量分析。用renin/renin receptor與β-actin比值表示 renin/renin receptor的mRNA表達(dá)水平。

1.7 放射免疫法檢測(cè)腎臟腎素活性 PBS緩沖液中加入1μg/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)蛋白酶抑制劑，100 mg腎組織加1 mL緩沖液，玻璃勻漿器勻漿，勻漿液在4℃下2000 r/min離心20 min，取上清液用放射免疫法檢測(cè)血管緊張素Ⅰ(angiotensinⅠ，AngⅠ)的含量。腎素活性是以AngⅠ的產(chǎn)生速率來(lái)衡量[7]。同時(shí)用BCA法檢測(cè)上清液總蛋白含量，放射免疫法測(cè)量值與總蛋白含量值相比得出含量百分比。具體方法參照試劑盒說(shuō)明書。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠生化指標(biāo)檢測(cè) DM組大鼠血糖明顯高于N組。DM組4周始尿蛋白較N組升高，8周時(shí)DM組24 h尿蛋白高于N組。DM組SCr較N組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表1。DM組腎質(zhì)量/體質(zhì)量比值與N組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩組間 SCr和血鈉、血鉀水平相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

2.2 大鼠腎臟病理改變 DM組PAS染色可見(jiàn)節(jié)段性的系膜基質(zhì)和系膜細(xì)胞的增生，DM組腎小球損傷指數(shù)顯著高于N組，見(jiàn)彩插Ⅰ圖1。

2.3 腎臟腎素和腎素受體表達(dá)改變 腎素主要分布于腎小管，以腎小球周圍近曲小管為主;腎素受體在腎臟表達(dá)廣泛，在腎小球系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、近端小管、遠(yuǎn)端小管均有表達(dá)，見(jiàn)彩插Ⅰ圖2、3。

2.4 腎素及腎素受體mRNA表達(dá) DM組腎素mRNA較N組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，腎素受體 mRNA與N組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖 4、圖5。

表1 各組大鼠血糖、尿蛋白量(24 h)和SCr的比較

表2 各組大鼠腎腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)、生化指標(biāo)的比較

圖1 兩組腎小球病理變化(PAS×400)

圖2 兩組腎素表達(dá)光密度值(IHC×400)

圖3 兩組腎臟腎素受體表達(dá)光密度值(IHC×400)

圖4 兩組腎臟腎素mRNA表達(dá)

圖5 兩組腎臟腎素受體(RnR)mRNA表達(dá)

2.5 腎臟腎素活性變化 DM組AngⅠ的含量較N組明顯升高[(5.14±1.05)×10-6比(2.12±0.58)×10-6，P＜0.05]。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)觀察到腎素在腎小球周圍區(qū)域如腎小管高表達(dá)，腎小球表達(dá)較弱。這可能與腎小球旁器是腎素的主要來(lái)源有關(guān)。以往認(rèn)為腎素原不過(guò)是腎素的前體，沒(méi)有生物學(xué)作用，而不被重視，腎素受體的發(fā)現(xiàn)改變了人們的認(rèn)識(shí)。2002年腎素受體被發(fā)現(xiàn)，它能夠增加腎素和腎素原的活性并誘導(dǎo)自身活化[8]。腎素/腎素原結(jié)合腎素受體激發(fā)2條通路:腎素原能夠催化血管緊張素產(chǎn)生激活傳統(tǒng)的 RAS，同時(shí)還能激活細(xì)胞內(nèi)絲裂素激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，M APK)通路，上調(diào)促纖維化基因表達(dá)誘導(dǎo)腎小球硬化[9]。本研究發(fā)現(xiàn)腎素受體在腎內(nèi)廣泛表達(dá)，腎小球的系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、近端小管、遠(yuǎn)端小管均有表達(dá)。這預(yù)示著腎素受體在機(jī)體的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。糖尿病大鼠腎臟病進(jìn)展與腎組織RAS激活有關(guān)，研究腎素受體在該系統(tǒng)的地位具有重要意義。目前，已有阻斷腎小球系膜細(xì)胞腎素受體可以延緩細(xì)胞外基質(zhì)蓄積的報(bào)道[10]。

已有研究表明糖尿病狀態(tài)下腎內(nèi) RAS激活[11]，局部RAS激活被認(rèn)為與糖尿病腎病腎功能惡化有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組腎素水平升高，放射免疫法證實(shí)糖尿病模型組腎臟腎素活性升高，Takahashi等[13]用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)17和29周糖尿病大鼠腎臟腎素受體表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照與糖尿病模型組腎素受體表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究模型組腎素受體表達(dá)變化與Takahashi等人研究一致。Schefe等[14]認(rèn)為腎素表達(dá)增加可通過(guò)短負(fù)反饋機(jī)制抑制腎素受體表達(dá)，即高腎素水平會(huì)抑制腎素受體的表達(dá)，防止腎素受體過(guò)度激活。Siragy和Huang[15]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎素受體表達(dá)增加，并提出該效應(yīng)可能是通過(guò)增強(qiáng)血管緊張素受體-1(AT1)-NADPH氧化酶活性，上調(diào)腎素受體表達(dá)。與本研究不同的是Siragy檢測(cè)的是6周糖尿病大鼠腎素受體表達(dá)情況，目前有關(guān)腎素受體的調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚，有待探討。盡管在本研究中兩組間腎素受體表達(dá)沒(méi)有差異，但是腎素活性增高可以通過(guò)激活RAS途徑，造成腎臟損害，在本實(shí)驗(yàn)中觀察到糖尿病大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生，系膜區(qū)基質(zhì)沉積，同時(shí)產(chǎn)生大量蛋白尿。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，腎素在腎小球周圍區(qū)域高表達(dá)，腎小球表達(dá)較弱。腎素受體在腎小球系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、近端小管、遠(yuǎn)端小管均有表達(dá)。糖尿病大鼠腎臟腎素表達(dá)增加，可能與腎臟損傷有關(guān)，但腎素受體表達(dá)無(wú)改變，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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