劉佑?xùn)|（廣西柳州畜牧獸醫(yī)學(xué)校，柳州 545003）

口蹄疫（food and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（food and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠(yuǎn)距離傳播的動(dòng)物疾?。?］。由于FMD暴發(fā)引起幼小動(dòng)物死亡、成年動(dòng)物生產(chǎn)能力降低，并由此而導(dǎo)致疫區(qū)畜產(chǎn)品禁運(yùn)，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。因此該病被國(guó)際獸醫(yī)局（OIE）列為第一位A類烈性傳染病。目前，F(xiàn)MD呈全世界范圍流行趨勢(shì)。口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，該病毒有七個(gè)血清型。O型口蹄疫為全世界流行最廣的一個(gè)血清型，我國(guó)流行的口蹄疫主要為O、A、C三型及ZB型（云南保山型）。接種疫苗是特異性預(yù)防口蹄疫的有效手段，安全有效的疫苗是成功預(yù)防、控制乃至最終消滅口蹄疫的先決條件，在口蹄疫的防控中，最早使用的疫苗是滅活苗，長(zhǎng)期以來(lái)，滅活苗在口蹄疫的防控中發(fā)揮了舉足輕重的作用，但同時(shí)也存在許多隱患，比如疫苗毒株毒力的返強(qiáng)造成二次感染等。隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)及免疫學(xué)等學(xué)科的迅猛發(fā)展，口蹄疫疫苗的研究也取得了較快的進(jìn)展，各種基因工程疫苗如亞單位疫苗、合成肽疫苗、重組活載體疫苗、核酸疫苗等不斷出現(xiàn)，為口蹄疫的防控開辟了新的途徑。本文就口蹄疫疫苗的研究概況進(jìn)行綜述，以期為口蹄疫的有效防控提供新的途徑。

1 傳統(tǒng)疫苗

1.1 弱毒苗

弱毒苗是指經(jīng)充分致弱，但尚能在動(dòng)物體內(nèi)增殖，接種后能夠引起動(dòng)物發(fā)生無(wú)癥狀的感染，從而使機(jī)體產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)持久免疫力的病毒制劑。病毒毒力弱化途徑包括雛雞化、鼠化、兔化、雞胚化等。該種疫苗具有價(jià)廉、成本低及免疫原性好、抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，但其引起免疫動(dòng)物病毒血癥、長(zhǎng)期帶毒、排毒及病毒返強(qiáng)等缺點(diǎn)卻一直無(wú)法克服，由于活疫苗具有上述缺陷，在很大程度上限制了其應(yīng)用，為了使口蹄疫疫苗更安全，人們開始探索一種比較安全可靠的新苗。

1.2 滅活疫苗

滅活疫苗是指用物理或化學(xué)方法使口蹄疫病毒喪失感染力而保留抗原性，再添加佐劑后制成的制劑。滅活劑主要有甲醛、結(jié)晶紫、乙?；蚁﹣啺罚ˋEI）、二乙烯亞胺（BEI）、乙基乙烯亞胺（EEI）等。滅活疫苗研究主要有3個(gè)重要環(huán)節(jié)：獲取大量的病毒抗原、選擇適宜的滅活劑和滅活方法、選擇適宜的無(wú)毒副作用的免疫佐劑。1925年，Vallee等采集了FMDV感染牛的水皰液，經(jīng)甲醛滅活，首次制成了FMD滅活疫苗。1926—1929年，Belin及其同事首次用FMD發(fā)病牛舌皮組織病料制造FMD甲醛滅活苗。1934年Schmidt和Hansen發(fā)現(xiàn)了無(wú)毒性且能增強(qiáng)免疫效力的氫氧化鋁膠佐劑。1935年荷蘭學(xué)者Frenkel用離體培養(yǎng)牛、羊、豬的胚胎皮膚，采用雞血漿固定組織塊的組織培養(yǎng)方法來(lái)培養(yǎng)FMDV獲得成功。1947年，F(xiàn)renkel又用牛舌上皮細(xì)胞培養(yǎng)法發(fā)展了自己創(chuàng)造的組織塊Frenkel培養(yǎng)法，并用其增殖FMDV，使大規(guī)模病毒抗原生產(chǎn)技術(shù)獲得成功。1952年Dulbecco首先用胰蛋白酶消化動(dòng)物的腎臟皮質(zhì)獲得初代單層腎上皮細(xì)胞，用其培養(yǎng)FMDV獲得成功。但是在1938年至1962年期間口蹄疫疫苗主要由動(dòng)物組織生產(chǎn)病毒抗原，經(jīng)甲醛滅活，氫氧化鋁膠吸附制成［2］。自1962年至今，BHK-21細(xì)胞已成為制備口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想細(xì)胞培養(yǎng)系［3］，從而廣泛應(yīng)用于口蹄疫疫苗生產(chǎn)。1965年Telling和Elsworth用發(fā)酵罐大量生產(chǎn)懸浮細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)病毒抗原，現(xiàn)在幾乎所有的口蹄疫滅活苗都以這種方法生產(chǎn)，但有研究證明甲醛在抗原的滅活中有活毒的殘留，目前廣泛引用的滅活劑是二乙烯亞胺［4］。目前世界上主要應(yīng)用滅活苗來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)口蹄疫的防制，除了滅火的單價(jià)苗之外，滅活二價(jià)苗也早已出現(xiàn)，張永光、王永錄等已研制成功的牛口蹄疫O型A型雙價(jià)滅活疫苗［5］。在預(yù)防?？谔阋叻矫嬉讶〉昧撕芎玫男Ч?。但越來(lái)越多的證據(jù)表明多次口蹄疫暴發(fā)與甲醛滅活苗有關(guān)，而氮丙啶類主要作用于核酸，蛋白抗原性保持較好，但毒性較大，從而引起的應(yīng)激使動(dòng)物的損失也較大，另外免疫性較差，所用種毒均為強(qiáng)毒，必須有嚴(yán)密的防范設(shè)施和嚴(yán)格的操作規(guī)程，存在生物安全隱患，生產(chǎn)難度大，成本較高，使用劑量基于上述問(wèn)題，迫切需要進(jìn)行新的口蹄疫疫苗研發(fā)。

2 新疫苗

鑒于傳統(tǒng)疫苗存在諸多問(wèn)題，有關(guān)科學(xué)工作者結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，開展新型疫苗的研制，朝著安全、高效、多價(jià)、經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展。20世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著分子生物學(xué)、免疫化學(xué)和生物工程學(xué)的深入發(fā)展，對(duì)口蹄疫新型疫苗的研究取得了較大進(jìn)展，主要有：基因工程疫苗、合成肽疫苗、活載體病毒疫苗、核酸疫苗（DNA疫苗）及綠色疫苗等。

2.1 基因工程亞單位疫苗

隨著生物技術(shù)在生物制品領(lǐng)域的應(yīng)用不斷深化和發(fā)展，近年成功研制了許多基因工程亞單位疫苗?；蚬こ虂唵挝灰呙纾╯ubunit vaccine）又稱重組亞單位疫苗或生物合成亞單位疫苗，是利用DNA重組技術(shù)將編碼病原微生物保護(hù)性抗原的基因?qū)胧荏w菌或細(xì)胞，使其在受體高效表達(dá)，分泌保護(hù)性抗原肽鏈，提取保護(hù)性抗原肽鏈并加入佐劑制成的亞單位苗。Kleid［6］等于1981年首次將口蹄疫保護(hù)性抗原基因VP1導(dǎo)入大腸桿菌，制備高純度VP1蛋白，接種?？墒古５挚箯?qiáng)毒的攻擊。我國(guó)臺(tái)灣的Wang J H等，將大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的重組VP1蛋白應(yīng)用SDS協(xié)助其重折疊，去除SDS，獲得純化的VP1單體和二聚體，后與口蹄疫抗體發(fā)生反應(yīng)，結(jié)果表明任何一種形式的重組VP1豬用疫苗，都能產(chǎn)生免疫反應(yīng)。鄭兆鑫等利用化學(xué)法合成了口蹄疫病毒VP1基因的兩種抗原表位序列，將其串聯(lián)后與半乳糖苷酶基因連接成融合蛋白基因在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，提取的融合蛋白制成亞單位疫苗免疫豬后能有效地防制口蹄疫病毒感染。而且對(duì)不同地區(qū)分離的“O”型毒株均有很好的交叉保護(hù)作用?；蚬こ桃呙缂夹g(shù)是一項(xiàng)新興的具有應(yīng)用前景的生物技術(shù)。通過(guò)將不同血清型病毒或多種病毒的免疫原性基因偶聯(lián)于同一載體，可以制成多價(jià)疫苗或多聯(lián)疫苗，降低生產(chǎn)成本、簡(jiǎn)化免疫程序，并且多聯(lián)苗還可克服不同病毒弱毒苗間產(chǎn)生的干擾現(xiàn)象，因此將是畜禽基因工程疫苗的重要方向。

2.2 合成肽疫苗

合成肽疫苗（synthetical peptide vaccine）是依據(jù)天然蛋白質(zhì)氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)用化學(xué)方法人工合成包含抗原決定簇的小肽（20～40個(gè)氨基酸），通常包含一個(gè)或多個(gè)B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位。該疫苗是一種完全基于病原體抗原表位或者決定簇氨基酸序列特點(diǎn)開發(fā)設(shè)計(jì)的一類疫苗，不存在毒力回升或滅活不全的問(wèn)題。特別是對(duì)于還不能通過(guò)體外培養(yǎng)方式獲得足夠量抗原的微生物病原體或雖能進(jìn)行體外培養(yǎng)，但有潛在致病性和免疫病理作用等涉及安全性與有效性問(wèn)題的病原體意義重大。合成肽疫苗的研究最早始于FMDV合成肽疫苗，研究重點(diǎn)主要集中在FMDV的單獨(dú)B細(xì)胞抗原表位或與T細(xì)胞抗原表位結(jié)合而制備的合成肽疫苗研究，雖然取得了一定的進(jìn)展，但仍未獲得一種具有理想保護(hù)作用的合成肽疫苗。分析合成肽疫苗免疫效果不佳的原因主要有：疫苗缺乏足夠的免疫原性，很難如蛋白質(zhì)抗原那樣誘導(dǎo)集體的多種免疫反應(yīng)；B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位很難發(fā)揮協(xié)同作用：缺乏足夠多的B細(xì)胞抗原表位的刺激。合成肽作為免疫原存在的一個(gè)普遍問(wèn)題是主要組織相容性復(fù)合體（MHC）的限制性，F(xiàn)MDV是典型的細(xì)胞依賴性體液免疫為主，單純B細(xì)胞位點(diǎn)肽誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性有限，因而T細(xì)胞表位的引入對(duì)提高肽段的免疫性意義重大。但T細(xì)胞表位的識(shí)別受MHC限制，非選擇性T11表位或病毒蛋白不同部分的特異性Tll表位的引入可極大解決這個(gè)問(wèn)題。1990年Doel［7-9］分別用A、O、C血清型FMDV VPl序列的141-158和200-213肽段組成的40個(gè)氨基酸合成肽，在牛和豚鼠進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)肽都產(chǎn)生高滴度的特異性抗病毒中和抗體，O、A型肽可完全保護(hù)豚鼠抵抗各同源病毒的攻擊，C型較差。2002年Wang［10］等以VPl G-H環(huán)及大量側(cè)翼序列為框架，將共有殘基整合進(jìn)入VPl高變區(qū)位點(diǎn)，并引入外源Th位點(diǎn)設(shè)計(jì)的合成肽疫苗，免疫豬后，以Taiwan株FMDV攻擊時(shí)獲得20/21保護(hù)率。

2.3 重組活載體疫苗

活載體疫苗，是將微生物保護(hù)性抗原基因即目的基因插入載體病毒如痘病毒、皰疹病毒等的特定位置上，使載體病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中復(fù)制的同時(shí)表達(dá)外源基因產(chǎn)物即抗原。一個(gè)載體病毒中可同時(shí)插入多個(gè)外源基因，表達(dá)多種病原微生物的抗原、同時(shí)起到預(yù)防多種傳染病的效果。近些年來(lái)，除了以病毒作載體以外，還有利用細(xì)菌作載體的疫苗的研究。在口蹄疫病毒載體疫苗研究中，腺病毒是應(yīng)用最為廣泛的載體之一。

腺病毒是一種單分子線狀雙股DNA病毒，基因組大小為34～43 kb，無(wú)囊膜，核衣殼呈20面體對(duì)稱，由252個(gè)殼粒組成，包括240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體及12根纖毛。除此之外，還有其他一些小蛋白，如Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅲα和Ⅳα2等。六鄰體形成病毒衣殼20個(gè)三角形面，12個(gè)頂端是5個(gè)五鄰體亞單位和3個(gè)纖毛蛋白共同構(gòu)成的復(fù)合物，12根纖毛以五鄰體蛋白為基底，由衣殼表面伸出，纖毛頂端形成頭節(jié)區(qū)。五鄰體和纖毛的頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，在病毒感染細(xì)胞過(guò)程中起著非常重要作用。腺病毒基因組兩端各有100～140 bp的一段末端倒置重復(fù)序列（inverted terminal repeat，ITR），這些ITR是病毒復(fù)制的起始位點(diǎn)，是病毒復(fù)制所必需的。在左端ITR的3′側(cè)有一段長(zhǎng)約300 bp的包裝信號(hào)（ψ），主要是介導(dǎo)腺病毒基因組包裝病毒衣殼。對(duì)腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號(hào)約0.5 kb的序列是順式作用元件，也就是說(shuō)，必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可以通過(guò)輔助病毒（或細(xì)胞）反式補(bǔ)給。近年來(lái)，口蹄疫病毒基因重組腺病毒活載體疫苗研究的比較多，已有報(bào)道多是以E1和E3編碼區(qū)的AdHu5為載體，有些載體還缺失了E4編碼區(qū)。Sanz-Parra等構(gòu)建了表達(dá)FMDV P1編碼區(qū)的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，經(jīng)鼻咽部和皮下兩種免疫途徑試驗(yàn)證明，兩次免疫牛后可產(chǎn)生部分的保護(hù)性免疫反應(yīng)。Mayr等構(gòu)建了含有FMDV P1-2A-3C基因A24/A12嵌合型重組腺病毒，根據(jù)3C劃分為突變型和野生型兩株重腺病毒，試驗(yàn)證實(shí)只有3C野生型重組腺病毒能夠?qū)⒕鄣鞍譖1裂解為VP0、VP1和VP3，并刺激動(dòng)物產(chǎn)生高水平的中和抗體，進(jìn)一步證明了3C蛋白酶對(duì)衣殼組裝是必需的；此重組腺病毒免疫豬體后分別于7、14、42 d用同型病毒攻擊，具有很好的保護(hù)作用［11］。

2.4 核酸疫苗

核酸疫苗，常被稱作DNA疫苗、“裸”DNA疫苗、基因疫苗、多核苷酸疫苗、基因免疫、核酸免疫、多核苷酸免疫等。即把外源的抗原基因克隆到質(zhì)?；虿《据d體上，然后將重組的質(zhì)?；虿《綝NA直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生以天然蛋白形式出現(xiàn)的抗原，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，并能夠持續(xù)地引發(fā)免疫反應(yīng)。核酸疫苗作為近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的生物技術(shù)，無(wú)疑具有廣闊的應(yīng)用前景，免疫期長(zhǎng)、成本較低、容易構(gòu)建和制備、穩(wěn)定性好，抗原遞呈過(guò)程與病原的自然感染相似，但在短期內(nèi)，DNA疫苗很難代替目前大量使用的傳統(tǒng)疫苗，隨著DNA疫苗研究的不斷深入，預(yù)計(jì)不久將會(huì)有新的突破。

3 展望

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用及其基因表達(dá)技術(shù)的發(fā)展，使人類有可能在生物體外合成有生理活性的蛋白質(zhì)及安全有效的細(xì)胞，病原抗原將為人類及動(dòng)物疾病的防治開辟?gòu)V闊前景。因此可以認(rèn)為在今后的口蹄疫防治方面，將可能研制生產(chǎn)出廉價(jià)、高效、安全的新型疫苗，為將來(lái)在世界范圍內(nèi)控制并最終消滅口蹄疫提供了可能。

［1］謝慶閣.口蹄疫［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

［2］杜進(jìn)鑫，王永錄.口蹄疫疫苗研究新進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2009（3）：4-8.

［3］潘麗，張永光.口蹄疫疫苗研究進(jìn)展［C］//中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)口蹄疫學(xué)分會(huì)第九次全國(guó)口蹄疫學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.蘭州：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，2003.

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