王躍華,林抗雪,劉益麗,馬良良,江明殊

(成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院,四川成都 610106)

0 引 言

我國是藥用植物資源極為豐富的國家之一,據(jù)調(diào)查,目前我國共有中藥資源12 807種,其中藥用植物11 146種,占87.03%[1].隨著經(jīng)濟的發(fā)展,人們對藥用植物資源的需求量與日俱增,藥用植物資源不僅局限于醫(yī)療用藥,而且還廣泛地應(yīng)用于美容、保健、飲食等其他方面.長期以來,大多數(shù)的藥用植物資源都靠野生采挖為主.由于許多藥用植物資源的過度開采和使用,其產(chǎn)量已逐年萎縮,特別是一些名貴藥用植物,如紅景天、川貝母和冬蟲夏草等,更是面臨著滅絕的危險.因此,對藥用植物種質(zhì)資源實施有效地保護已是一項十分緊迫的任務(wù).

1 藥用植物種質(zhì)資源超低溫保存技術(shù)

1.1 藥用植物種質(zhì)資源超低溫保存基本原理

通常將-80℃以下的溫度稱為超低溫.超低溫冷凍保存一般以液氮為冷源,使溫度維持在-196℃左右.從理論上分析,生物材料在此溫度下,其活細胞內(nèi)的新陳代謝和生長活動幾乎完全停止,處于“生機停頓”狀態(tài),從而能夠有效保持生物材料的遺傳穩(wěn)定性,同時又可保持生物材料的形態(tài)發(fā)生潛能,這是一種不需要靠繼代而可長期保存植物種質(zhì)的有效方法.

1.1.1 細胞凍害理論.

植物組織結(jié)冰分為胞外結(jié)冰和胞內(nèi)結(jié)冰兩種.胞外結(jié)冰是指在溫度降低時,細胞間隙和細胞壁附近的水分結(jié)成冰,隨著細胞間隙的蒸汽壓降低,其周圍細胞內(nèi)的水分便向胞間隙方向移動,擴大了冰晶的體積.胞內(nèi)結(jié)冰是指溫度迅速下降,除了胞外結(jié)冰外,細胞內(nèi)的水分也凍結(jié).

細胞凍害是指在細胞內(nèi)外形成的冰晶對細胞造成的傷害.據(jù)文獻報道,細胞產(chǎn)生胞外結(jié)冰后會引起原生質(zhì)過度脫水,造成冰晶體對細胞的機械損傷以及蛋白質(zhì)變性等傷害.在冷凍降溫過程中,許多植物細胞對低溫下細胞外結(jié)冰具有一定的耐受力.但是如果植物細胞內(nèi)的水結(jié)冰,冰晶在形成和融化時會對細胞產(chǎn)生直接的機械破壞作用,使得細胞結(jié)構(gòu)的完整性遭到嚴重的破壞而無法進行正常的生理功能,從而帶來致命損傷.

1.1.2 溶液玻璃化理論.

1.2 藥用植物種質(zhì)資源超低溫保存基本程序

1.2.1 材料的選擇.

研究表明,植物的基因型、抗凍性以及組織和細胞的年齡、選擇材料的大小等因素都對超低溫保存效果產(chǎn)生較大的影響,其中植物細胞的生長年齡是決定凍存后細胞存活率的最重要因素之一[3].這是因為處于不同生長階段的植物材料具有不同的生理狀態(tài),處于快速生長期的材料凍后存活率較高.目前,常用的超低溫保存材料主要有莖尖分生組織、愈傷組織、植物器官3大類.

(1)莖尖分生組織細胞具有分化程度低的特點,在植物保存后的再生過程中,比其他細胞培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性好,所以莖尖分生組織是超低溫保存的一種理想材料[5].目前,已成功實現(xiàn)莖尖超低溫保存的藥用植物有高山紅景天、地黃、百合等[6-8].劉劍鋒等[6]采用包埋—玻璃化法對高山紅景天莖尖進行保存,保存后材料最高成活率接近100%,再生植株生長和分化正常.薛建平等[7]采用玻璃化法保存地黃莖尖,其存活率在76.42%以上.陳輝等[8]通過正交設(shè)計試驗初步建立了切花百合種質(zhì)玻璃化法超低溫保存的技術(shù)方案,百合無菌苗莖尖保存后進行恢復(fù)培養(yǎng),存活率可達到50%以上.

(2)愈傷組織是植物組織培養(yǎng)中最為常見的組織培養(yǎng)物,具有生長速度快,可分化成為各種組織和器官的潛力等特點.但由于愈傷組織在長期繼代培養(yǎng)過程中會伴隨發(fā)生染色體的自發(fā)畸變,因此對藥用植物愈傷組織的保存顯得尤為重要.目前,已成功實現(xiàn)愈傷組織超低溫保存的藥用植物有浙貝母、高山紅景天、銀杏和紅豆杉等[9-13].蘇新等[9]研究發(fā)現(xiàn),超低溫保存浙貝母愈傷組織中,經(jīng)慢速冷凍后的愈傷組織存活率可達78.2%,且成功實現(xiàn)增殖及植株再生.劉劍鋒等[10]研究表明,采用玻璃化法保存高山紅景天愈傷組織后存活率可達到78.24%,解凍后可誘導(dǎo)成苗.徐剛標等[11]對銀杏子葉愈傷組織進行了超低溫保存研究,采用分步冷凍法進行超低溫保存后其細胞相對存活率可達60%以上,恢復(fù)培養(yǎng)時細胞能恢復(fù)生長.

(3)花粉是重要的植物種質(zhì)形式之一,具有豐富的遺傳多樣性,是種質(zhì)保存以及雜交育種的重要材料[14].花粉的保存方式一般采用超低溫保存,其是將花粉進行預(yù)處理和適當脫水后直接投入液氮中.目前,已見報道的實現(xiàn)花粉超低溫保存的藥用植物有人參、浙貝母、杜仲、山茱萸和高山紅景天等[14-16].蘇新[15]用分步冷凍法保存浙貝母花粉發(fā)現(xiàn),經(jīng)低溫保存后的花粉授粉后能有效結(jié)實.劉劍鋒等[16]研究發(fā)現(xiàn)高山紅景天花粉的超低溫保存過程中,逐步預(yù)凍法與逐步解凍法均能大幅度提升超低溫保存后花粉的萌發(fā)力.

1.2.2 材料的預(yù)處理.

為了使保存材料達到超低溫保存所要求的低含水量等生理特性,必須對材料進行預(yù)處理,其目的是為了提高處于分裂期細胞的數(shù)目,減少細胞內(nèi)自由水含量,增強細胞抗寒力.目前,材料預(yù)處理采用的具體方法有低溫鍛煉、繼代培養(yǎng)和預(yù)培養(yǎng)3種.

Connections of summer anomalous precipitation in Guangdong and Guangxi regions with SST anomalies east of

(1)低溫鍛煉法通常是將需要保存的材料放在0℃左右溫度下處理數(shù)天至數(shù)星期,也可分不同溫度組進行變溫處理,以提高細胞膜磷脂的不飽和程度而增加抗低溫的能力,還可使細胞發(fā)生保護性脫水和產(chǎn)生抗凍蛋白[17].

(2)繼代培養(yǎng)法是將處于快速生長期的材料進行多次轉(zhuǎn)接繼代,此預(yù)處理方法可大大增加有絲分裂細胞的數(shù)目.研究表明,處于有絲分裂前后的細胞抗凍能力較強,其繼代培養(yǎng)后的材料也具有較高的抗凍能力,其凍后存活率也隨之提高[18].

(3)預(yù)培養(yǎng)法是在培養(yǎng)基中加入冷凍保護劑如山梨醇、二甲基亞砜等,或誘導(dǎo)產(chǎn)生抗寒力的物質(zhì)如脫落酸、海藻糖等,當培養(yǎng)基中的冷凍保護劑進入細胞組織后可使細胞內(nèi)外形成滲透壓,細胞可緩和的脫去部分水,而脫落酸、海藻糖等物質(zhì)可誘導(dǎo)細胞分泌抗寒物質(zhì).目前,該方法常與低溫鍛煉結(jié)合,已在多種植物中獲得成功.

1.2.3 冷凍保護劑選擇與冷凍處理方法.

(1)在藥用植物種質(zhì)資源的超低溫保存過程中,不管采用何種冷凍方法,冷凍保護劑都是不可缺少的.理想的冷凍保護劑應(yīng)能在超低溫保存過程中保護組織免受冰凍傷害,且適當濃度下對細胞無毒或低毒,解凍后容易從組織中清除.目前廣泛使用的冷凍保護劑分為滲透性和非滲透性兩種.滲透性冷凍保護劑包括二甲基亞砜、甘油、乙二醇等,此類保護劑多數(shù)為低分子中性物質(zhì),在溶液中易結(jié)合水分子發(fā)生水合作用,使溶液的粘性增加,弱化了水的結(jié)晶過程,從而起到了保護效果;非滲透性保護劑包括蔗糖、山梨醇、聚乙二醇等,這類物質(zhì)能溶于水,但不能進入細胞,它能使細胞間溶液呈過冷狀態(tài),阻止胞外結(jié)冰從而起到保護作用.孫成龍等[19]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合保護劑優(yōu)于單一保護劑,其優(yōu)越性在于它能充分發(fā)揮各種成分的保護作用,從而產(chǎn)生累加效應(yīng).所以在冷凍保護的實際過程中,人們常使用由兩種或兩種以上的保護劑組成的復(fù)合保護劑.

目前,復(fù)合保護劑為可分為滲透性與滲透性結(jié)合型、滲透性與非滲透性結(jié)合型和非滲透性與非滲透性結(jié)合型3大類型.

(2)冷凍處理是超低溫保存過程中非常關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié),在冷凍處理過程中,隨著溫度的降低細胞內(nèi)有形成冰晶的危險,因此其降溫速度應(yīng)該是以不引起胞內(nèi)凍結(jié)或形成冰晶為準.目前所采用的冷凍方法可分為基于快速降溫的冷凍法、基于保護性脫水的冷凍法和基于玻璃化理論的冷凍法等.

快速降溫的冷凍方法是以快速降溫時溶液缺乏形成晶核的時間從而避免細胞內(nèi)結(jié)冰為理論基礎(chǔ).快速降溫法的具體步驟是將植物材料從0℃或預(yù)處理溫度直接投入液氮中,使溫度瞬時降到-196℃,在此過程中細胞內(nèi)的水分子未來得及形成結(jié)晶中心從而避免了細胞內(nèi)結(jié)冰的危險.此方法簡單,不需復(fù)雜、昂貴的設(shè)備,但由于快速冷凍法沒有采用保護性脫水環(huán)節(jié),因此該方法適用于含水量低或可高度脫水的植物材料,如種子、花粉等[9].

基于保護性脫水的冷凍方法,包括慢速冷凍法、分步冷凍法和逐級降溫法.慢速冷凍法的步驟為,材料以0.5℃/min～2℃/min的降溫速度,使溫度從0℃降到-100℃左右,再立即投入液氮中保存;分步冷凍法的步驟為,材料以0.5℃/min～4℃/min的降溫速度,降到-40℃左右,停留一段時間再立即投入液氮;逐級冷凍法的步驟為,將植物材料經(jīng)過冰凍保護劑0℃預(yù)處理后,再逐級通過-10℃、-15℃、-23℃、-35℃、-40℃等,每級溫度停留10 min左右,然后投入液氮中[20].植物材料在逐步降溫的過程中,可使細胞內(nèi)水分充分脫出,從而有效地避免了植物材料在冷凍保存過程中產(chǎn)生細胞內(nèi)結(jié)冰,以達到良好的保存效果,此3種冷凍方法都適用于液泡化程度較高的植物材料.

玻璃化冷凍方法是根據(jù)玻璃化理論建立的一種簡單而高效的冷凍方法.該方法在快速降溫的同時采用高濃度復(fù)合保護劑,通過玻璃化溶液弱化水結(jié)晶以及使溶液呈過冷狀態(tài)從而使組織或細胞在-196℃形成無定形玻璃化狀態(tài),而沒有冰晶的形成,減少了對細胞的損傷,提高了植物材料的存活率.玻璃化冷凍法主要步驟有裝載、保護劑(即玻璃化溶液)處理和冷凍幾個環(huán)節(jié),其中裝載時間和玻璃化溶液處理時間對凍后材料存活率的影響很大,因此玻璃化法保存材料的關(guān)鍵在于裝載時間和玻璃化溶液處理時間的掌握[21].

1.2.4 解凍洗滌及凍后材料細胞相對存活率測定.

為了防止凍后植物材料次生結(jié)冰,一般采用快速解凍的方法,即將液氮保存后的材料在25℃～40℃的水浴中解凍.同時,凍存后植物材料的洗滌也很重要,洗滌的主要目的是除去高濃度的冷凍保護劑和防止細胞因過度吸水而脹破.

凍后植物材料細胞相對存活率的測定目前廣泛采用TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)染色法[22]. TTC是標準氧化還原色素,氧化狀態(tài)無色被還原后變成紅色.TTC染色法是通過測定呼吸鏈脫氫酶活性來表征細胞代謝活力的一種有效方法,其原理是TTC在細胞呼吸過程中替代氧接受 H+(H+/e), TTC被還原為TTF而呈現(xiàn)紅色,TTF經(jīng)有機溶劑萃取后,在一定波長下測吸光值,其吸收值大小能反映細胞膜電子傳遞鏈的遞氫能力大小.有機物氧化分解生成的氫通過呼吸鏈與受氫體氧結(jié)合而產(chǎn)生能量是細胞能量代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié),傳遞給氧的氫越多,說明脫氫酶活性越高.由于脫氫酶只有活細胞體才能產(chǎn)生,因此,常用脫氫酶活性表達細胞體的活性. TTC染色法通過間接測定脫氫酶的活性,脫氫酶的活性可反映細胞呼吸強度的大小,而細胞呼吸強度可在一定程度上表征細胞活力.

TTC染色是一個酶促反應(yīng),所涉及的因素較多如緩沖液的濃度和pH值、TTC的濃度、處理的時間和溫度等,而且在TTF的提取過程中往往會有所損失,造成結(jié)果不夠準確.此外,脫氫酶的活性并不能完全表征細胞的活力,因此,凍后材料細胞相對存活率的測定方法仍有待提高.

1.2.5 凍后材料遺傳穩(wěn)定性的檢測.

植物種質(zhì)資源保存的最根本目的是保持其遺傳基因的穩(wěn)定性,控制遺傳性狀不發(fā)生變化.因此,超低溫凍存后材料的遺傳特性的檢測是十分必要的.目前,凍存后植物材料的遺傳特性的檢測主要從形態(tài)學(xué)和細胞學(xué)特征觀察、同工酶分析以及RAPD和AFLP分析等方面對超低溫保存的植物材料的遺傳穩(wěn)定性進行檢測.Liu Y等[23]對超低溫保存后蘋果莖尖的遺傳穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)其與正常蘋果莖尖在形態(tài)學(xué)、可溶性蛋白和POD酶、DNA水平上均無差異.

2 結(jié) 語

超低溫保存技術(shù)是一項可長期保存藥用植物種質(zhì)資源的有效方法,具有長期性和穩(wěn)定性的優(yōu)點,并避免了田間藥用植物種質(zhì)資源保存需要花費巨大的人力、物力、財力的缺點.據(jù)統(tǒng)計,采用此技術(shù)保存的藥用植物材料,可在其后的幾十年里根據(jù)人們的需要將其取出并用于生產(chǎn)研究,從而有效地保護了瀕危野生藥用植物的種質(zhì)資源.

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