王倫學，李 力，谷穎東，徐永莉，張月云，趙成堅

（中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所廣西分所 廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023）

犬卵母細胞體外成熟的研究進展

王倫學，李 力，谷穎東，徐永莉，張月云，趙成堅

（中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所廣西分所 廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023）

闡述了影響犬卵母細胞體外成熟的各種因素，總結(jié)概括了目前新的培養(yǎng)方法，并對國內(nèi)的研究現(xiàn)狀及前景作了思考，以期為研究犬卵母細胞體外成熟研究提供參考。

犬；卵母細胞；減數(shù)分裂；體外成熟；輔助生殖技術

目前，犬卵母細胞體外成熟效率很低[1-13]。據(jù)報道，犬卵母細胞恢復減數(shù)分裂比例為0～58%，而發(fā)育至MⅡ期比例平均為20%[14]。犬卵母細胞體外成熟所采用的培養(yǎng)液大多借鑒其它家畜動物，如豬和牛的體外成熟系統(tǒng)，而很少研究考慮犬種屬特異性。犬體外成熟體系與其它哺乳動物相比仍不完善，這可能與犬卵母細胞具有不同的體外成熟機理有關。目前已有較多報道嘗試采用不同培養(yǎng)基，在其中添加蛋白質(zhì)、黏多糖及輸卵管上皮細胞共培養(yǎng)，但卵母細胞體外發(fā)育至MⅡ期比例仍無大幅度提高。因此，若要發(fā)展犬體外受精和胚胎發(fā)育等輔助生殖技術，必須提高犬卵母細胞體外成熟效率。本文綜述了影響犬卵母細胞體外成熟因素及目前采用的培養(yǎng)方法，為深入探索優(yōu)良的體外培養(yǎng)體系作參考。

1 影響因素

1.1 卵母細胞質(zhì)量和直徑

研究發(fā)現(xiàn)，犬卵巢中存在很高比例（20%～68%）的退化卵母細胞[13]。Farstad W等在1993年發(fā)現(xiàn)高達68%的犬卵母細胞發(fā)生形態(tài)退化，不能用于體外成熟?？赡芘c犬年齡及發(fā)情周期及卵母細胞分離方法有關。犬卵母細胞多數(shù)采用手術刀片切碎卵巢組織而分離獲得，卵母細胞多數(shù)是從卵巢組織內(nèi)卵泡中獲取的。分離過程中可能對卵泡和卵母細胞結(jié)構(gòu)有機械損傷。另外，從屠宰場或?qū)櫸镝t(yī)院獲取的犬卵巢多數(shù)處于間情期，卵巢表面充滿皺褶且無明顯卵泡。卵母細胞全是從卵巢內(nèi)卵泡中分離到的，分離出的卵母細胞多數(shù)已發(fā)生退化，可用于體外成熟的卵母細胞數(shù)量有限。僅少數(shù)研究抽吸卵巢表面卵泡中卵母細胞用于研究，用此方法獲取的卵母細胞質(zhì)量較高。所以卵母細胞數(shù)量和質(zhì)量是制約犬卵母細胞體外成熟進展的重要因素[15]。

在其它哺乳動物研究中發(fā)現(xiàn)，卵母細胞減數(shù)分裂成熟能力與卵泡直徑[16-19]和卵母細胞直徑有關[20，21]。目前，Hewitt和England發(fā)現(xiàn)直徑最大組（＞100μm）卵母細胞成熟能力大于直徑中等組（100μm），直徑中等組卵母細胞成熟能力大于直徑小組（＜100μm）。T Otoi等在2000年研究發(fā)現(xiàn)，直徑大于等于120 μm組卵母細胞發(fā)育至MⅡ期達到21.5%，顯著高于直徑小于100 μm組（0%）以及直徑為100～120 μm組（4.9%）[22]。此研究表明卵母細胞減數(shù)分裂能力與卵母細胞直徑大小成正比。此研究同時發(fā)現(xiàn)直徑小于100 μm的卵母細胞不能發(fā)育至MⅡ期，而卵母細胞直徑達120 μm才具有減數(shù)分裂能力。這表明卵母細胞直徑可作為衡量體外成熟（IVM）效率的一個重要指標。另外，卵母細胞減數(shù)分裂能力可能與培養(yǎng)體系有關。而目前體外培養(yǎng)體系不成熟及成熟效率普遍低下，因此很難評估不同直徑卵母細胞體外成熟能力。

N Songsasen[23]從直徑小于2 mm卵泡中獲取卵母細胞，卵丘細胞為2層或以上并且細胞質(zhì)黑而均勻的卵母細胞用于體外成熟。分離出的卵母細胞直徑可達120 μm，與體內(nèi)的卵母細胞直徑相同[24]，并具有充分的發(fā)育能力。但是，卵母細胞體外成熟卻停滯在第1次減數(shù)分裂中期（MⅠ），他們推測這與卵泡直徑有關，而與卵母細胞直徑無關。此研究表明從直徑大于2 mm卵泡中獲取卵母細胞用于體外成熟是最佳選擇。

1.2 供體因素

1.2.1 生殖周期

多數(shù)報道認為，犬卵母細胞成熟能力與生殖周期無關[25-28]。其中，DAHewitt和GCWEngland發(fā)現(xiàn)發(fā)情前期和發(fā)情期之間，以及間情期和發(fā)情后期之間卵母細胞體外成熟能力差異不顯著[25]。M Hishimuma等研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)情間期（8.8%）和子宮積膿期（6.0%）卵巢中卵母細胞體外成熟72 h后，發(fā)育至MⅡ比例差異不顯著。Berenice de Avila Rodrigues等報道從子宮積膿期卵巢獲取的1級和2級卵母細胞發(fā)育至MⅡ期的比例與其它生殖周期相似[29]。其中子宮積膿期卵母細胞發(fā)育至MⅡ期比例低至10%，這與其他幾篇報道結(jié)果類似[10，11，27，28]。另外，Berenice de Avila Rodrigues[28]發(fā)現(xiàn)各生殖周期間卵母細胞發(fā)育至MⅡ能力差異不顯著[28]（卵泡期：5.4%；間情期：4.2%；發(fā)情后期：4.4%；子宮積膿期：8.1%；妊娠期：4.7%），恢復減數(shù)分裂能力（GVBD-MⅡ）之間亦差異不明顯（卵泡期：24.6%；間情期：19.6%；發(fā)情后期：16.4%；子宮積膿期：37.1%；妊娠期：29.2%）。

僅有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)犬卵母細胞成熟能力與生殖周期有關。MK Kim等在體外成熟液中添加17β-雌二醇（E2）和孕酮（P4），檢測其對犬卵母細胞成熟的影響[30]。卵泡期卵母細胞在添加2μg/mL的17 β-雌二醇的TCM-199成熟液中培養(yǎng)后，發(fā)育至MⅡ比例（14.7%）顯著高于（P＜0.05）發(fā)情后期（5.6%）和間情期（5.6%）卵母細胞，并且也顯著高于其它組（1.5%～8.2%）。表明不同發(fā)情周期卵母細胞體外成熟能力與成熟液成分有關。

1.2.2 月份和季節(jié)

Nucharin Songsasen等統(tǒng)計各季節(jié)（春季：3～5月份；夏季：7～8月份；秋季：9～11 月份；冬季:12至次年2月份）卵母細胞成熟能力，其發(fā)育至MⅡ比例分別是 20.8±4.7%，20.5±2.8%，23.8±4.7%，17.8±5.2%。此研究表明月份和季節(jié)不影響狗卵母細胞體外成熟能力（P＞0.05）[31]。

1.2.3 年齡

D A Hewitt等比較不同年齡犬卵巢中卵母細胞成熟能力大小[32]，發(fā)現(xiàn)1～6歲犬卵母細胞恢復減數(shù)分裂能力（67%）大于7歲或年齡更大組（34%），同時1～6歲犬卵母細胞完成核成熟能力（MI/AI/MⅡ：25%）亦大于7歲或年齡更大的（4%）。隨年齡增大，卵巢組織更加老化，其卵母細胞質(zhì)量越低，卵母細胞減數(shù)分裂能力越小。若要提高犬卵母細胞體外成熟效率，需優(yōu)先選擇年齡較小犬的卵巢組織中卵母細胞。

1.3 激素

1.3.1 孕酮

孕酮（P4）是多數(shù)哺乳動物卵母細胞成熟促進因子。已有較多研究表明孕酮對卵母細胞成熟有積極或消極作用。如Gould和Graham研究發(fā)現(xiàn)孕酮能促進恒河猴卵母細胞體外成熟至MⅡ能力[33]。而DeMarais和Racowsky發(fā)現(xiàn)孕酮對倉鼠卵母細胞成熟有抑制作用[34]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度孕酮使小鼠卵母細胞處于減數(shù)分裂停滯狀態(tài)[35]。

有關孕酮對犬卵母細胞成熟作用研究不多，且不同研究所得結(jié)論不一致。如Hewitt在體外成熟液中添加1.0μg/mL孕酮，能促進犬卵母細胞減數(shù)分裂恢復能力[5]。而Willingham-RockyLA等發(fā)現(xiàn)添加高濃度孕酮（從0～8 000 ng/mL），對犬卵母細胞減數(shù)分裂恢復以及核成熟都沒有顯著促進作用[36]。MKKim等發(fā)現(xiàn)孕酮能刺激（P＜0.05）犬卵泡期卵母細胞體外核成熟至MⅡ能力[30]。同時發(fā)現(xiàn)，含E2（2μg/mL）的培養(yǎng)液中添加孕酮（0～2.0μg/mL）與單獨添加E2相比，能進一步促進或抑制卵母細胞核成熟。其中低濃度孕酮（0.5μg/mL）顯著降低卵母細胞發(fā)育至MⅡ能力（3.4%），而高濃度孕酮（2μg/mL）能顯著促進卵母細胞發(fā)育至MⅡ能力（16.6%）。此研究表明，孕酮對犬卵母細胞成熟作用可能依賴于很多因素，如培養(yǎng)基中添加的激素。

1.3.2 hCG

Monica De los Reyes等采用分段培養(yǎng)方法研究hCG對犬卵母細胞體外成熟作用。此研究中分段培養(yǎng)即卵母細胞首先在含10 IU/mL的hCG培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，然后在不含hCG培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞在含10 IU/mL的hCG培養(yǎng)液中持續(xù)培養(yǎng)96 h，其發(fā)育至MⅡ比例（MⅡ：33.1%）高于未添加hCG組（MⅡ：20.7%），但差異不顯著。同時發(fā)現(xiàn)采用上述分段培養(yǎng)法，卵母細胞發(fā)育至MⅡ比例高達43.4%，明顯高于對照組。此研究是犬卵母細胞體外成熟效率較高的報道之一[12]。但hCG對犬卵母細胞體外成熟作用機制仍不清楚。

1.3.3 eCG，F(xiàn)SH和LH

N Songsasen等發(fā)現(xiàn)犬卵母細胞在eCG中短暫處理能促進其發(fā)育MⅠ期及以后時期。他們把犬卵母細胞放置在eCG中處理60～240 min，能顯著提高卵母細胞發(fā)育至 MⅠ-MⅡ比例（P＜0.05）[23]。其中，用0.5 IU/mLeCG處理60～240 min，有30%～44%卵母細胞發(fā)育至MⅠ-MⅡ，而對照組（無eCG處理組）僅有14%發(fā)育至MⅠ-MⅡ。但eCG處理120 min對照組相比，卵母細胞發(fā)育至GV，GVBD和MⅠ-MⅡ比例都差異不顯著。作者認為這是由于不同重復實驗中卵母細胞對eCG反映不同所導致的。

上述eCG對犬卵母細胞成熟促進作用機制沒有研究清楚。eCG對犬卵母細胞成熟促進作用可能是通過FSH活性產(chǎn)生的。已報道小鼠和豬卵母細胞中FSH能刺激卵丘細胞分泌減數(shù)分裂刺激物質(zhì)[37，38]而促進卵母細胞成熟。Byskov A G等發(fā)現(xiàn)小鼠卵母細胞在FSH中處理30 min能促進GVBD發(fā)生[37]，F(xiàn)SH作用24 h能促進減數(shù)分裂恢復和核成熟。但已有研究表明，在培養(yǎng)液中添加FSH/LH（單獨或聯(lián)合作用），都不能促進犬卵母細胞成熟[5，7，11]，這可能與促性腺激素作用導致雌激素/孕酮比例改變有關。Ding和Foxcroft發(fā)現(xiàn)成熟液中添加促性腺激素能改變豬顆粒細胞類固醇激素合成比例[39]，其中雌激素/孕酮比例改變。而成熟液中雌激素/孕酮比例變化能影響一些物種卵母細胞核成熟能力[7，39，40]。因此，建議下步實驗可以研究犬卵母細胞在激素作用下（短暫處理或者較長時間作用）顆粒細胞合成激素濃度變化，以此來探索激素是如何影響犬卵母細胞成熟能力的。

1.4 卵丘細胞

在各種家畜動物中，卵丘卵母細胞復合體（COCs）中卵丘細胞擴展被認為是卵母細胞成熟的一個重要指標[41，42]。因此，卵丘細胞擴展可被認為是犬卵母細胞成熟的一個標志。但研究發(fā)現(xiàn)犬卵母細胞體外成熟時卵丘細胞很少發(fā)生擴展[43，44]，并且體內(nèi)卵丘細胞和卵母細胞之間聯(lián)系從受精至桑葚胚期持續(xù)存在[45]。已報道藍狐卵母細胞體外成熟過程中卵丘擴展規(guī)律與犬相同，這可能是由于藍狐與犬在親緣關系較近。因此犬科動物卵丘擴展具有特殊性[11，46]，可能是由于其卵母細胞質(zhì)成熟不充分[47]。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)犬科動物卵丘細胞擴展與卵母細胞成熟不成正比關系[11，46]。如Srsen等發(fā)現(xiàn)FSH能刺激狐貍卵母細胞中卵丘細胞擴展，但沒有發(fā)現(xiàn)卵母細胞發(fā)育至MⅡ[46]。相反，在培養(yǎng)液中添加牛生長激素時卵丘細胞未發(fā)生擴展，但發(fā)現(xiàn)有40%卵母細胞已完成核成熟。另外，N Songsasen等發(fā)現(xiàn)生長因子（GH）能刺激犬卵母細胞中卵丘擴展[11]，但不能提高卵母細胞成熟效率。不同研究出現(xiàn)不同效果可能與不同犬科動物卵母細胞和卵丘細胞對生長因子反映不同有關。但有一篇文章報道隨卵丘細胞擴展程度加大，成熟效率逐漸提高[12]。即Monica De los Reyes等在培養(yǎng)液中添加10 IU/mL hCG能顯著刺激（P＜0.05）犬COCs中卵丘擴展，并且10 IU/mLhCG能提高COCs發(fā)育至MⅡ能力[12]。同時發(fā)現(xiàn)卵丘擴展在COCs培養(yǎng)96 h后卵丘擴展程度沒有繼續(xù)增強。

1.5 培養(yǎng)基、血清和能量

1.5.1 培養(yǎng)基

N Songsasen等研究無蛋白培養(yǎng)基中各種因子，能量對犬卵母細胞成熟作用。發(fā)現(xiàn)犬卵母細胞在無蛋白培養(yǎng)基中能完成核成熟[11]。同時發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基對犬卵母細胞成熟效率有顯著差異（P＜0.05）。其中卵母細胞在TCM199培養(yǎng)基中成熟48 h有13%（6/121）發(fā)育至MⅡ，而在CMRL1066培養(yǎng)基中發(fā)育至MⅡ很低，在135枚卵母細胞中僅發(fā)現(xiàn)1枚發(fā)育至MII。

1.5.2 血清

Oh HJ等研究不同發(fā)情期犬血清對犬卵母細胞體外成熟能力作用[48]。發(fā)現(xiàn)卵泡期卵母細胞在含10%發(fā)情期犬血清（14.2%）成熟液中體外成熟72 h，發(fā)育至MⅡ比例顯著高于（P＜0.05）其它組（5.2%；6.3%；FBS∶2.2%；2.2%）。同時10%發(fā)情期犬血清組（MⅡ∶13.5%）發(fā)育至MⅡ比例顯著（P＜0.05）高于其它濃度組（5%∶1.3%；20%∶5.1%；對照∶2.7%）。因此，成熟液中添加10%發(fā)情期犬血清對犬卵泡期卵母細胞體外成熟是必需的。本人研究發(fā)現(xiàn)，屠宰場和寵物醫(yī)院中獲取的卵巢多數(shù)處在非卵泡期。為珍惜卵巢資源，建議在上述研究基礎上，繼續(xù)研究10%發(fā)情期犬血清對其它發(fā)情期卵巢中卵母細胞成熟效率影響。

1.5.3 能量

有報道表明，僅在培養(yǎng)液中添加葡萄糖作為能量，不能完全促進小鼠卵母細胞核成熟能力。如Downs和Mastropolo報道小鼠卵母細胞在僅含葡萄糖為能源的培養(yǎng)基中能恢復減數(shù)分裂[49]，但僅有很小部分卵母細胞排出第1極體，而在培養(yǎng)液中添加0.23 mmol/L丙酮酸鹽能顯著提高卵母細胞發(fā)育至MⅡ能力。上述研究結(jié)論可能對犬卵母細胞體外成熟適用。已有研究嘗試在高氧（20%）條件下葡萄糖對犬卵母細胞體外成熟作用。發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖（11.0 mmol/L）對犬卵母細胞核成熟有損害作用。但Hashimoto等發(fā)現(xiàn)在低氧濃度（5%）條件下，在含20 mmol/L葡萄糖成熟液中多數(shù)卵母細胞能發(fā)育至MⅡ[50]。因此，高濃度葡萄糖（11.0 mmol/L）可能促進卵母細胞核成熟，但前提是卵母細胞在低氧條件下成熟，可能是由于低氧條件下能量消耗主要依賴于葡萄糖所致。因此，若要闡明能量對犬卵母細胞成熟作用，還需從分子水平深入研究。

1.6 培養(yǎng)密度

T Otoi等研究培養(yǎng)密度對犬卵母細胞成熟能力影響[10]，發(fā)現(xiàn)不同密度下卵母細胞減數(shù)分裂能力與供體所處生殖周期有關。發(fā)情后期卵巢中卵母細胞在一定體積（100μL）液滴中培養(yǎng)時，10枚/100μL組發(fā)育至MⅡ比例（16.2%）比例顯著（P＜0.05）高于5枚/100μL（4.6%）及其它組。在間情期組，10枚/100μL，15枚 /100μL發(fā)育至 MⅡ比例分別為10.4%和11.3%，而兩者間差異不顯著，但都高于其它組。表明培養(yǎng)液滴體積相同條件下，卵母細胞成熟能力與生殖周期有關。另外實驗比較了相同培養(yǎng)密度和不同培養(yǎng)液滴體積條件下卵母細胞成熟能力大小。發(fā)現(xiàn)發(fā)情后期卵巢卵母細胞組中，10枚/100μL組發(fā)育至MⅡ比例（10.4%）高于1枚/10μL和5枚/50μL組，但都差異不顯著。而在間情期組中，各組發(fā)育至MⅡ比例皆在10%左右，差異不顯著。表明在培養(yǎng)密度相同條件下，培養(yǎng)液滴體積大小不影響發(fā)情后期和間情期卵巢卵母細胞體外成熟能力。所以，下步實驗需要闡明培養(yǎng)液滴密度和體積是如何影響不同發(fā)情周期卵母細胞成熟能力。

1.7 溫度

截止目前，犬卵母細胞體外成熟多采用37℃[12，28]，38.5℃[12，30，51]和 39℃[25，52，53]。但無研究比較不同溫度下犬卵母細胞體外成熟能力大小。

僅有研究比較不同溫度下犬卵母細胞活性大小。H SLee等比較了4℃和38℃時卵母細胞活性[54]。發(fā)現(xiàn)保存（0 h），4℃與38℃活性差異不顯著（79.6%∶83.9%）。保存24 h，4℃下活性（13.2%）顯著小于38℃下的活性（77.8%）（P＜0.05）。保存 48 h后，4℃下卵母細胞活性為0，顯著（P＜0.05）小于 38℃（72.9%）。此研究表明，犬卵母細胞對溫度很敏感。而Bolamba等報道腔前卵泡中卵母細胞在4℃下保存，48h（36.4%）和 72h（44.4%）組間退化率差異不顯著[55]。上述不同研究結(jié)果可能與以下因素有關：（1）冷凍液體不同；（2）染色方法不同；（3）判斷標準不同。在別的物種中，如EcEvoy TG等認為豬卵母細胞對低溫敏感，主要是由于豬卵母細胞中含有高濃度脂肪滴及與所含有的細胞膜成分[56]。他們發(fā)現(xiàn)卵丘包裹的GV期卵母細胞在低于等于15℃下不能存活[57]。犬卵母細胞中亦含有高濃度脂肪滴，在低溫條件下，犬卵母細胞質(zhì)膜中由于脂質(zhì)損害而降低犬卵母細胞活性。

1.8 各種因子

1.8.1 減數(shù)分裂抑制因子

N Songsasen等研究發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂抑制劑roscovitine不能顯著抑制犬卵母細胞減數(shù)分裂能力[23]，其中25 μmol/L roscovitine處理24 h 60%卵母細胞（共56枚卵母細胞）處于生發(fā)泡期（GV期），與對照組（不添加roscovitine）比較差異不顯著。同時研究發(fā)現(xiàn)dbcAMP顯著（P＜0.05）抑制犬卵母細胞減數(shù)分裂恢復能力，并且呈劑量依賴式。其中犬卵母細胞在5 mmol/L，10 mmol/L dbcAMP中作用24 h，分別有65%（共51枚卵母細胞）和54%（共63枚卵母細胞）卵母細胞處于生發(fā)泡期，顯著（P＜0.05）高于對照組（不添加dbcAMP的23.8%）。實驗同時發(fā)現(xiàn)dbcAMP處理24 h犬卵母細胞產(chǎn)生的抑制效應是可逆的，犬卵母細胞在dbcAMP中處理24 h，然后在無dbcAMP中作用48 h，其發(fā)育至MⅡ比例與無dbcAMP組相同。此結(jié)論與小鼠及豬卵母細胞是一致的[58，59]。

1.8.2 生長激素

Berenice de Avila Rodrigues等分別比較TCM199成熟液中添加1μg/mL雌二醇，20 μg/mL雌二醇和1μg/mL人生長激素對犬卵母細胞成熟作用，發(fā)現(xiàn)兩組間卵母細胞體外成熟72 h發(fā)育至MⅠ/MⅡ比例差異不顯著（14.1%∶10.2%）[26]。但實驗沒有比較雌二醇和人生長激素單獨作用對犬卵母細胞成熟的作用。

1.8.3 β-巰基乙醇和EGF

β-巰基乙醇（β-ME）和表皮生長因子（EGF）通過合成谷胱甘肽（GSH）保護卵母細胞和胚胎免受氧化反應所致?lián)p害。已發(fā)現(xiàn)EGF能促進人、牛、豬和嚙齒類動物卵母細胞體外成熟能力。KimMK等研究β-ME和EGF對不同發(fā)情期犬卵母細胞體外成熟作用[60]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加50 mmol/L或100 mmol/L β-ME能顯著促進卵泡期卵母細胞發(fā)育至MⅡ能力。與其它發(fā)情周期卵母細胞相比，25 mmol/L或100 mmol/Lβ-ME能顯著促進卵泡期卵母細胞發(fā)育至MⅠ能力。另外，與其它發(fā)情周期卵母細胞相比，20 ng/mLEGF能顯著促進卵泡期卵母細胞發(fā)育至MⅡ能力。因此，β-ME和EGF對犬卵母細胞成熟作用依賴于發(fā)情周期。未來需要進一步研究β-巰基乙醇和表皮生長因子是如何促進卵泡期卵母細胞發(fā)育能力，為優(yōu)化犬卵母細胞體外成熟體系作參考。

1.9 體內(nèi)來源卵母細胞

SYamada等對比格犬進行超數(shù)排卵[2]，發(fā)現(xiàn)從卵巢中抽吸獲取的卵母細胞都處于生發(fā)泡期（GV）。當卵母細胞體外成熟24 h，9.1%卵母細胞發(fā)育至MⅡ。當體外成熟48 h，卵丘細胞開始擴展，27.3%發(fā)育至MⅡ。而培養(yǎng)時間延長至72 h，高達31.9%卵母細胞發(fā)育至MⅡ，并且卵丘細胞持續(xù)擴展。此研究表明，體內(nèi)來源的卵母細胞核成熟能力與卵丘細胞擴展成正比。但作者沒有報道卵母細胞體外發(fā)育72 h的發(fā)育能力。建議在此實驗基礎上延長體外成熟時間，檢測卵母細胞最大發(fā)育潛能。另外，需要比較相同培養(yǎng)條件下體內(nèi)和體外卵母細胞成熟能力大小。

2 新培養(yǎng)方法

為了模擬犬卵母細胞體內(nèi)成熟過程，有較多研究采用細胞共培養(yǎng)（包括胚胎成纖維細胞、顆粒細胞、輸卵管上皮細胞），輸卵管液共培養(yǎng)及結(jié)扎輸卵管共培養(yǎng)以期望進一步提高卵母細胞體外成熟效率。

2.1 細胞共培養(yǎng)

2.1.1 胚胎成纖維細胞

S Hatoya等研究了小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）和犬胚胎成纖維細胞（CEF）對犬卵母細胞體外成熟（IVM）、體外受精（IVF）和體外胚胎發(fā)育（IVC）的影響。發(fā)現(xiàn)CEF能促進犬卵母細胞體外發(fā)育至16-細胞，MEF能促進犬卵母細胞發(fā)育至桑椹胚[51]。表明胚胎成纖維細胞（MEF，CEF）能夠促進犬卵母細胞核成熟和細胞質(zhì)成熟。

2.1.2 顆粒細胞和犬腎細胞

MPtaszynska研究了牛顆粒細胞和犬腎細胞對犬卵母細胞成熟的作用，結(jié)果表明牛顆粒細胞和犬腎細胞都能促進犬卵母細胞體外成熟。

2.1.3 輸卵管上皮細胞

Camila Infantosi Vannucchi等研究犬輸卵管上皮細胞對卵母細胞核成熟作用[53]。在成熟液添加20 μg/mL雌二醇時，卵母細胞成熟96 h僅有5.2%發(fā)育至MⅡ，其它組更少比例發(fā)育至MⅡ期，此培養(yǎng)體系需要優(yōu)化。另外發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中添加孕酮能降低卵母細胞退化率（孕酮組：17.1%～25%；無孕酮組：42.3%～76.7%）。此實驗所取樣本量少，如每組實驗所取卵母細胞24～67枚，此結(jié)論需進一步證實。

2.1.4 人工合成輸卵管液（SOF）

D A Hewitt研究人工合成輸卵管液（SOF）對犬卵母細胞成熟作用[61]。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中添加SOF，卵母細胞成熟48 h并不能促進減數(shù)分裂恢復（GVBD）（SOF+0.3%BSA組:45%；SOF+4%BSA組:36%；medium 199組:27%）和核成熟（MⅠ/AⅠ/MⅡ，SOF+0.3%BSA組:5%；SOF+4%BSA組:7%；對照199組:6%）。同時，在SOF液中添加低濃度牛血清白蛋白（0.3%BSA）不能促進核成熟，而在SOF液中添加高濃度牛血清白蛋白（4%BSA）能促進核成熟。此原因需要進一步研究。在SOF液中添加低濃度牛血清白蛋白（0.3%BSA組:27%），卵母細胞體外成熟96 h核成熟能力受抑制，而對照組（63%）或SOF液添加高濃度BSA組（4%BSA組:62%）能促進核成熟能力。牛血清白蛋白對犬卵母細胞成熟的作用可能與SOF成分有關。

2.2 結(jié)扎輸卵管共培養(yǎng)

為了模擬體內(nèi)卵母細胞成熟發(fā)生在輸卵管的過程。Luvoni G C等研究分離出的輸卵管共培養(yǎng)對犬卵母細胞成熟作用[62]。發(fā)現(xiàn)卵母細胞與結(jié)扎輸卵管共培養(yǎng)時，有12.5%～31.9%的卵母細胞發(fā)育至MⅠ/MⅡ。當卵母細胞與結(jié)扎輸卵管共培養(yǎng)30 h，有63.8%卵母細胞恢復減數(shù)分裂，顯著高于（P＜0.001）液滴培養(yǎng)組（20.4%）及開放輸卵管組（27.1%）。隨體外成熟時間延長，減數(shù)分裂恢復比例降低，體外成熟24 h（69.2%）和30 h（59.1%）減數(shù)分裂恢復比例顯著高于48 h（35.8%）。另外，卵母細胞在輸卵管中共培養(yǎng)時間延長至48h，卵母細胞退化比例（退化率：59.3%）顯著高于體外培養(yǎng)24 h組（18.7%）和30 h組（27.3%）。較高的退化率原因不清楚。若通過降低退化率有可能進一步提高卵母細胞發(fā)育至MII能力。

2.3 二維培養(yǎng)方法

Fulton R等在1998年從犬卵巢組織中分離出早期有腔卵泡（EAN）和晚期腔前卵泡（APAN）。培養(yǎng)前在培養(yǎng)皿底鋪滿膠原，把卵泡放置在含TCM199成熟液中培養(yǎng)72 h，發(fā)現(xiàn)有較多比例卵母細胞（82/213，38.5%）發(fā)育至MⅡ[63]。表明犬卵泡中卵母細胞在二維培養(yǎng)體系中成熟能力較大。

2.4 卵泡培養(yǎng)方法

目前僅有一篇文章研究卵泡包被的卵母細胞放置于微滴中進行培養(yǎng)中[64]。他們首先在體外分離出早期有腔卵泡（EAN）和晚期腔前卵泡（APAN）。發(fā)現(xiàn)體外分離出的卵泡中卵母細胞有少數(shù)已發(fā)育至MⅠ/MⅡ（APAN：0.9% ；EAN:0.9%），表明卵母細胞在卵巢中可以恢復減數(shù)分裂。為了保持卵泡三維結(jié)構(gòu)，防止顆粒細胞損失，在培養(yǎng)皿底部鋪滿瓊脂。發(fā)現(xiàn)卵泡包被的卵母細胞在此條件下體外成熟24 h，APAN（5.3%，20/374）中卵母細胞發(fā)育至MⅠ/MⅡ比例顯著高于（P＜0.05）體外成熟 0 h組（0.9%，3/318），體外成熟 48 h發(fā)育至 MⅠ/MⅡ比例增大（P＜0.05）（11.5%，47/407），但成熟至72 h發(fā)育至MⅠ/MⅡ沒有繼續(xù)增加（9.9%，40/404）。而EAN體外成熟24 h卵母細胞發(fā)育至MⅠ/MⅡ比例增加不顯著，而成熟至 48 h增加顯著（8.7%，11/126）（P＜0.05），成熟至 72 h發(fā)育至MⅠ/MⅡ增加亦不顯著（7.5%，8/106）。表明卵泡包被的卵母細胞（APAN，EAN）在培養(yǎng)起初階段，核成熟能力隨培養(yǎng)時間延長而增大。隨培養(yǎng)時間延長，核成熟能力沒有顯著提高。

3 國內(nèi)研究進展

目前，國內(nèi)有關犬卵母細胞體外成熟研究不多[65，66]，成熟效率不高。潘和平研究培養(yǎng)溫度對蘭州土狗卵母細胞體外成熟的影響，發(fā)現(xiàn)37.0℃對COCs卵丘細胞擴展作用明顯高于36.5℃，但此研究沒有觀察卵母細胞核相，其結(jié)論需進一步證實。葉華虎采集發(fā)情期和間情期犬卵巢中卵母細胞，發(fā)現(xiàn)發(fā)情期大于2 mm和1～2 mm腔前卵泡中卵母細胞體外成熟效率（MⅠ/AⅠ/MⅡ：42.5%，32.5%）顯著高于間情期卵巢中卵母細胞（20.4%），并且卵丘擴展與卵母細胞成熟存在相關性。另外發(fā)現(xiàn)發(fā)情期犬血清能誘導卵丘擴展，但不能有效提高卵母細胞成熟效率。因此，需要更深入研究犬卵母細胞體外成熟機理，以提高體外成熟效率。

4 展望

鑒于目前仍沒有找出優(yōu)良的體外成熟體系，需要在前人研究基礎上，采用先進的實驗技術和新穎的實驗思路，以優(yōu)化體外成熟體系。如采用分子生物學方法，基因芯片原理和技術，二維蛋白電泳技術研究犬卵母細胞體外成熟機理。

5 致謝

感謝中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物技術國家重點實驗室張坤博士對本論文寫作方面的幫助和建議。

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S829.2

B

1005-2739（2010）01-0001-08

2009-09-23

王倫學，男，博士，助理研究員。