凌 娜,季宇彬,于 蕾,鄒 翔

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心哈爾濱 150076;2.抗腫瘤天然藥物教育部工程研究中心,哈爾濱 150076)

野西瓜(Capparis spinosa,CS)為白花菜科山 柑仔屬植物,又稱老鼠瓜、刺山柑、瓜兒菜、槌果藤,維語(yǔ)稱“波里克果”或“卡盤”,是荒漠、半荒漠、干旱、半干旱地區(qū)極有栽培價(jià)值的抗旱植物[1].主要分布于歐洲、北美、大洋洲、亞洲西部,我國(guó)新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、西藏等省區(qū).野西瓜的藥用部位為葉、果和根皮.在新疆省內(nèi)廣泛用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、瘡毒、肩周炎、皮炎和瘧疾等疾病[2-4].國(guó)內(nèi)有多位學(xué)者研究了野西瓜中的揮發(fā)油成分[5-7],但對(duì)野西瓜揮發(fā)油誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制報(bào)道較少.本研究通過(guò) MTT、SRB及 Annexin V/PI雙染體外試驗(yàn)來(lái)觀察野西瓜揮發(fā)油對(duì)人肝癌 HepG-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,并探討其作用機(jī)制.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品及試劑

野西瓜揮發(fā)油由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所提供.RPMI-1640干粉(美國(guó) GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季青),胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶 (PI)、MTT、磺酰羅丹明 B(Sulforhodamine B,SRB)均為 Sigma公司產(chǎn)品,Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒(美國(guó) Biovison公司),阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司).

1.2 腫瘤細(xì)胞系

人肝癌細(xì)胞株HepG-2,由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所提供,于 RPMI 1640培養(yǎng)液中加入 10%的胎牛血清,青霉素 100 u/m L,鏈霉素 100 mg/L,置 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),3～4 d傳代 1次.

1.3 儀器和設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱(美國(guó) NBS公司),酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司),倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS公司),流式細(xì)胞儀 (美國(guó) BECKMAN-COULTER公司,EPICSXL),超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠),電子分析天平(Sartorius),TDL80-2B低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測(cè)野西瓜揮發(fā)油對(duì) HepG-2細(xì)胞的抑制作用

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG-2細(xì)胞,消化后懸浮在一定量的培養(yǎng)液中,計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/m L,接種于 96孔板,每孔 100μL,置 37℃,CO2體積分?jǐn)?shù)為 5%的飽和濕度條件下培養(yǎng).待 24 h細(xì)胞完全貼壁后,試驗(yàn)組加入揮發(fā)油至終質(zhì)量濃度為 10、50、100、150、200 μg/mL;陽(yáng)性對(duì)照組阿霉素的質(zhì)量濃度為 0.01、0.1、1、10μg/m L;空白對(duì)照組加相同體積的培養(yǎng)液,每個(gè)劑量設(shè) 6個(gè)平行樣,繼續(xù)培養(yǎng) 72 h后,棄去上清液后,每孔加入MTT染液 100μL(0.5 mg/m L),繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,棄上清每孔加入 DMSO 200μL震蕩 5～10m in后,使用酶標(biāo)儀檢測(cè) 570 nm處吸光度,并按中效方程計(jì)算IC50

抑制率(%)=(1-試驗(yàn)孔平均 OD值 /對(duì)照孔平均 OD值)×100%

2.2 SRB法檢測(cè)野西瓜揮發(fā)油對(duì) HepG-2細(xì)胞的抑制作用

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG-2細(xì)胞用胰酶消化后調(diào)成濃度為 3×104/m L的細(xì)胞液,每孔 100μL接種于 96孔板.培養(yǎng) 24 h后加入野西瓜揮發(fā)油至終濃度為 10、50、100、150、200和 300 μg/mL,陽(yáng)性對(duì)照組阿霉素的質(zhì)量濃度為 0.01、0.1、1、10μg/m L空白對(duì)照組加相同體積的培養(yǎng)液,每個(gè)劑量設(shè) 6個(gè)平行樣,同時(shí)測(cè)定此時(shí)細(xì)胞的 OD515值(T0).72后棄上清,加 50%的冷三氯乙酸(TCA)液,置 4℃冰箱中固定 1 h,倒掉固定液,用去離子水洗 5遍,干燥后加 4mg/mL SRB染液,室溫放置 30min;倒掉染液用 1%醋酸洗 5遍,過(guò)夜干燥,加濃度為 10 mmol/L的 Tris緩沖液 150μL,10 min后測(cè)定 OD值,波長(zhǎng)為 515 nm.用如下公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率,并按中效方程計(jì)算 IC50.計(jì)算細(xì)胞50%生長(zhǎng)抑制所需的藥物質(zhì)量濃度(GI50);細(xì)胞完全生長(zhǎng)抑制所需的質(zhì)量濃度(TGI);殺死 50%細(xì)胞所需的藥物質(zhì)量濃度(LC50)[8].

公式:生長(zhǎng)率%=[(T-T0)/(C-T0)]×100%細(xì)胞殺死率%=[(T-T0)/T0]×100%

其中:GI50為[(T-T0)/(C-T0)]=50%時(shí)的藥物濃度;TGI為 T=T0時(shí)的藥物質(zhì)量濃度;LC50為[(T-T0)/T0]=-50%時(shí)的藥物質(zhì)量濃度;C表示對(duì)照組細(xì)胞的 OD值;T表示加藥組細(xì)胞的OD值;T0表示加藥時(shí)對(duì)照平板細(xì)胞的 OD值.

2.3 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG-2細(xì)胞,用胰酶消化后調(diào)成濃度為 3×105/mL的細(xì)胞液,每孔 1mL接種于 6孔板中.培養(yǎng) 24 h后加入野西瓜揮發(fā)油至終質(zhì)量濃度為 75、150和 300μg/m L,陽(yáng)性對(duì)照組阿霉素質(zhì)量濃度為 5μg/m L;空白對(duì)照組加相同體積的培養(yǎng)液.24 h后收集細(xì)胞,冷 PBS洗細(xì)胞 2次,細(xì)胞數(shù)(1～5)×105個(gè)/m L.將細(xì)胞重懸于 500 μL的 1×Binding Buffer,然后加入 5μL Annexin V-FITC和 10μL PI染色液,室溫避光孵育 5 min離心去上清,PBS洗 1次,最后將細(xì)胞重懸于 1 m PBS,用流式細(xì)胞儀分析,激發(fā)光波長(zhǎng)用 488 nm,用波長(zhǎng)為 515 nm的通帶濾器檢測(cè) FITC熒光,另一波長(zhǎng)大于 560 nm的濾器檢測(cè) PI.

2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用 SPSS11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,結(jié)果以±S表示,組間比較采用方差檢驗(yàn).

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 MTT法檢測(cè)野西瓜揮發(fā)油對(duì) HepG-2的細(xì)胞毒作用

MTT結(jié)果顯示,野西瓜揮發(fā)油對(duì) HepG-2細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用,并呈劑量依賴性,藥物的質(zhì)量濃度 -抑制率曲線呈 S形,符合 Logistic曲線.根據(jù)生長(zhǎng)抑制率采用綜合法計(jì)算半數(shù)抑制量 IC50,MTT結(jié)果顯示野西瓜揮發(fā)油對(duì) HepG-2細(xì)胞的 IC50值為 127.5μg/mL.

3.2 SRB法檢測(cè)野西瓜揮發(fā)油對(duì) HepG-2腫瘤細(xì)胞增殖的影響

SRB是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料,粉紅色,可溶于水.此實(shí)驗(yàn)方法的原理是 SRB可與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合,在 515 nm的 OD讀數(shù)與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系,故可用作細(xì)胞數(shù)的定量.用該方法觀察了野西瓜揮發(fā)油對(duì)體外培養(yǎng)的 HepG-2細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果如表1.

表1 野西瓜揮發(fā)油對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖的影響(SRB)

3.3 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡

應(yīng)用 Annexin V聯(lián)合 PI雙染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析,正?；罴?xì)胞 Annexin V和 PI均為低染;細(xì)胞凋亡早期的細(xì)胞膜完整,Annexin V高染,細(xì)胞膜呈綠色熒光,PI低染,細(xì)胞核不著色;凋亡中、晚期細(xì)胞則 Annexin V和 PI均高染,細(xì)胞膜呈綠色熒光,細(xì)胞核呈紅色熒光.獲取的數(shù)據(jù)用 Annexin V-FITC熒光強(qiáng)度 (FL1)為 X軸,PI熒光強(qiáng)度(FL2)為 Y軸的散點(diǎn)圖分析.用十字標(biāo)記(Maker)將圖像分為 4個(gè)象限,左下象限顯示活細(xì)胞,為(FITC-/PI-);右下象限為早期凋亡細(xì)胞,顯現(xiàn)(FITC+/PI-);左上象限為壞死細(xì)胞,為(FITC+/PI+);右上象限為晚期凋亡細(xì)胞,為(FITC+/PI+).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,75μg/mL和 150μg/mL的野西瓜揮發(fā)油作用于 HepG-2細(xì)胞 24 h后,活細(xì)胞數(shù)為 93.4%～93.2%,早期凋亡細(xì)胞為 5.3%～5 5%;300μg/mL的野西瓜揮發(fā)油作用于 HepG-2細(xì)胞 24 h后活細(xì)胞數(shù)量減少到 84.3%,早期凋亡細(xì)胞增至 13.7%.5μg/mL的阿霉素組 HepG-2細(xì)胞中活細(xì)胞數(shù)僅為 3.8%,晚期凋亡及壞死細(xì)胞分別為 52.9%和 42.1%(圖1).

4 討 論

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是指在生理或病理狀態(tài)下,細(xì)胞啟動(dòng)自身基因調(diào)控機(jī)制而發(fā)生的有序的、主動(dòng)的自然死亡過(guò)程,是正常細(xì)胞維持群體數(shù)量穩(wěn)定,清除轉(zhuǎn)化細(xì)胞,防止癌變所必需的生命活動(dòng)之一.它的異常與許多疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān).

細(xì)胞凋亡的早期事件之一是:細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸(Phosphatidyl serine,PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外.目前應(yīng)用 Annexin V聯(lián)合 PI雙染色法是檢測(cè)細(xì)胞凋亡較為理想的方法之一[9]PS位于正常細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),但在細(xì)胞凋亡的早期,PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面,暴露在細(xì)胞外環(huán)境中,Annexin V是一種分子質(zhì)量為 35～36 ku的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白,能與 PS高親和力特異性結(jié)合,它可以作為探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的 PS.碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種核酸染料,不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜,但在凋亡中、晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞中,PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染.將 Annexin V標(biāo)記上異硫氰酸熒光素(FITC),同時(shí)結(jié)合使用 PI拒染法進(jìn)行凋亡細(xì)胞雙染后利用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡[10].該方法可將凋亡早、中、晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來(lái):正常活細(xì)胞 Annexin V和 PI均低染,不著色;凋亡細(xì)胞的早期,Annexin V高染,細(xì)胞膜呈綠色熒光,P低染,細(xì)胞核不著色;凋亡中、晚期細(xì)胞則 Annexi V和 PI均高染,細(xì)胞膜呈綠色熒光,細(xì)胞核呈紅色熒光.獲取的數(shù)據(jù)用 Annexin V-FITC熒光強(qiáng)度(FL1)為 X軸,PI熒光強(qiáng)度(FL2)為 Y軸的散點(diǎn)圖分析.用十字標(biāo)記(Maker)將圖像分為 4個(gè)象限,一般把 Annexin V-FITC染色陰性/PI染色陰性的活細(xì)胞劃在左下象限中,把 Annexin V-FITC染色陽(yáng)性/PI染色陰性的凋亡細(xì)胞劃在右下象限中,左上象限中是 Annexin V-FITC染色陽(yáng)性/PI染色陽(yáng)性的死亡細(xì)胞.左上象限中多無(wú)細(xì)胞,但當(dāng)樣品為機(jī)械分散的實(shí)體組織細(xì)胞或細(xì)胞誘導(dǎo)處理作用過(guò)強(qiáng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),可有不等數(shù)量的細(xì)胞出現(xiàn)在該象限中,其中可能包括細(xì)胞膜已丟失的裸核細(xì)胞(核結(jié)構(gòu)完整)[11].與傳統(tǒng)方法比較,Annexin V聯(lián)合 PI雙染色法檢測(cè)凋亡細(xì)胞不需要固定,靈敏性、特異性高,結(jié)果更為可靠.其最大特點(diǎn)是檢測(cè)細(xì)胞膜尚未破裂的早期凋亡細(xì)胞,并可區(qū)別不同的細(xì)胞群體,以觀察這些細(xì)胞群中有無(wú)細(xì)胞凋亡過(guò)程.

圖1 不同質(zhì)量濃度的野西瓜揮發(fā)油對(duì)HepG-2細(xì)胞形態(tài)的影響

以野西瓜揮發(fā)油作用于 HepG-2細(xì)胞,通過(guò)MTT法驗(yàn)證野西瓜揮發(fā)油對(duì) HepG-2細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用,且具有劑量依賴關(guān)系,72 h的 IC50為127.5μg/m L.SRB結(jié)果顯示低質(zhì)量濃度的野西瓜揮發(fā)油通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)而起抗癌作用,其GI50約為 131.98μg/m L,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到 301.91 μg/m L時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)受到完全抑制,隨著濃度繼續(xù)增加至 168.24μg/mL時(shí)有一半數(shù)量的細(xì)胞被殺死.采用 Annexin V/PI雙染色法,流式細(xì)胞儀檢測(cè)到 HepG-2細(xì)胞凋亡的情況.隨著野西瓜揮發(fā)油劑量的增加,凋亡細(xì)胞數(shù)呈上升趨勢(shì).研究還發(fā)現(xiàn)野西瓜揮發(fā)油可使 HepG-2細(xì)胞發(fā)生 Gl期阻滯,阻斷細(xì)胞周期進(jìn)入 S期,導(dǎo)致線粒體膜電位的降低和鈣超載[12-13].進(jìn)一步說(shuō)明了野西瓜揮發(fā)油通過(guò)啟動(dòng)線粒體途徑誘導(dǎo) HepG-2細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制 HepG-2細(xì)胞的生長(zhǎng).

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