朱德淳,李然偉,劉祿成,溫都蘇,魏 巍

(吉林大學第二醫(yī)院泌尿外科,吉林長春 130041)

重組腺病毒載體攜帶反義微小RNA-21對膀胱癌細胞生長的作用

朱德淳,李然偉,劉祿成,溫都蘇,魏 巍

(吉林大學第二醫(yī)院泌尿外科,吉林長春 130041)

目的探討重組腺病毒載體介導的微小RNA-21(miRNA-21)反義寡核苷酸(ASOND)對人膀胱癌細胞株T24生長的影響。方法構(gòu)建反向插入miRNA-21基因的重組腺病毒載體(rAV-miRNA-21),并用反義rAV-miRNA-21轉(zhuǎn)染T24,即病毒載體用藥組。采用噻唑藍(MTT)法和原位末端標記(TUNEL)法檢測T24細胞的增殖和凋亡情況。同時設對照組和空病毒組作為對比。結(jié)果rAV-miRNA-21用藥組、對照組和空病毒組T24細胞的增殖率分別為(37.1±6.8)%、(95.7±5.8)%、(86.3±7.5)%;凋亡率分別是(31.6±4.7)%、(8.4±2.9)%、(7.3±4.6)%。 用藥組的增殖率和凋亡率分別與對照組和空病毒組相比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),而對照組與空病毒組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)論反義miRNA-21重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染T24細胞可以抑制腫瘤細胞增殖,增加細胞凋亡,進而抑制膀胱癌細胞生長。

膀胱腫瘤;微小 RNA-21;重組腺病毒;基因治療

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1351)

膀胱癌細胞能過度表達癌基因微小RNA-21(miRNA-21),其表達與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關,高miRNA-21表達的患者預后不良[1,2]。本研究通過構(gòu)建反向攜帶miRNA-21基因的重組腺病毒載體(rAV-miRNA-21),觀察miRNA-21反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASOND)對人膀胱癌細胞株T24增殖和凋亡的影響,從而為膀胱癌的基因治療尋找更為有效的新方法并提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 人膀胱癌細胞株T24購自中國科學院上海細胞所。腺病毒表達載體PDC316-EGFP-U6系統(tǒng)購自本元正陽公司。限制性內(nèi)切酶等各種工具酶購自BioLabs公司。反義和隨機對照寡核苷酸購自上海吉瑪制藥技術有限公司。反義miRNA-21 序列(AS-miRNA-21)為 5′CTCAACTGGTGTCGGCAACATCG3′,隨機對照序列為5′UCUACUCUUUCUAGGUUGUGA3′。在 Genbank中行 Blastn證實ASOND與任何已知哺乳動物基因無匹配。反義miRNA-21重組腺病毒載體(rAV-miRNA-21)的制備方法參考文獻[3]。

1.2 方法 ①檢測反義rAV-EGFP對T24細胞的轉(zhuǎn)染率:取對數(shù)生長期的T24細胞接種于96孔培養(yǎng)板,每組3復孔,每孔細胞數(shù)為1×103個,37℃培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)68 h后每孔分別加入含rAV-EGFP的培養(yǎng)液,37℃孵育4 h,輕輕吸去上清后分別用熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察并測定熒光蛋白(EGFP)表達情況。②評價反義rAV-miRNA-21對T24細胞增殖的影響:取對數(shù)生長期的T24細胞,分別加入rAV-miRNA-21和rAV-MCS,68h后提取細胞基因組,PCR擴增反義miRNA-21目的片段,凝膠電泳正確后測序,測序正確后取對數(shù)生長期的T24細胞,相差顯微鏡觀察感染細胞變化,MTT染色及電鏡觀察細胞狀態(tài),最后用MTT比色法檢測T24細胞增殖率。③測定反義rAV-miRNA-21誘導T24細胞凋亡率:按照反義rAV-miRNA-21組(病毒載體用藥組),rAV-MCS組(空病毒組)和空白對照組分為3組。每組取對數(shù)生長期的T24細胞分別接種于96孔培養(yǎng)板,每組3復孔,每孔細胞數(shù)為1×103個,37℃培養(yǎng)24 h后輕輕吸去上清。每組分別加進rAV-miRNA-21、rAV-MCS和生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)68 h后每孔分別加TUNEL反應液,37℃孵育4 h后棄上清。用原位末端標記(TUNEL)法檢測T24細胞凋亡率。實驗重復3次,結(jié)果取3孔平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計學軟件處理,組間差異比較用 t檢驗,結(jié)果用±s表示,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 rAV-EGFP對T24細胞的轉(zhuǎn)染 rAV-EGFP轉(zhuǎn)染T24細胞68h后用熒光顯微鏡看到大量細胞表達有綠色熒光蛋白編碼基因(EGFP)的腺病毒,熒光蛋白表達率接近100%,綠色熒光分布在以細胞核為主的整個細胞中,見圖1。

圖1 綠色熒光蛋白(EGFP)在T24細胞表達結(jié)果

2.2 rAV的生物活性 在T24細胞被轉(zhuǎn)染病毒顆粒68 h后提取細胞基因組,PCR擴增目的基因片段,1%凝膠電泳見到大約1.5 Kb長的基因片段,測序結(jié)果與預期序列一致。提示反義rAV-miRNA-21能夠感染T24細胞,具有生物活性,見圖2。

圖2 反義 miRNA-21重組腺病毒在T24細胞表達結(jié)果

2.3 T24細胞增殖率 MTT比色法分別檢測反義rAV-miRNA-21組、rAV-MCS組和空白對照組T24細胞增殖率。3組結(jié)果見表1。rAV-miRNA-21組和另外兩組間分別比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),而rAV-MCS和對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。上述統(tǒng)計結(jié)果表明反義rAV-miRNA-21具有抑制T24細胞增殖的生物學活性。

2.4 T24細胞凋亡率 TUNEL法檢測3組T24細胞凋亡率的結(jié)果見表1。顯示病毒載體用藥組分別與空病毒組和空白對照組相比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。而空病毒組與空白對照組比較,詫異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。提示反義rAV-miRNA-21在單細胞水平可以誘導腫瘤細胞凋亡,見圖3。

表1 各組 T24細胞增殖率和凋亡率的比較(±s)

表1 各組 T24細胞增殖率和凋亡率的比較(±s)

注:與rAV-MCS組比較,※P＜0.01;與空白對照組比較,△P＜0.01

組別 n T24細胞增殖率(%)T24細胞凋亡率(%)反義 rA V-miRNA-21組 50 37.1±6.8※△ 31.6±4.7 rAV-MCS組 30 86.3±7.5 8.4±2.9空白對照組 30 95.7±5.8 7.3±4.6

3 討論

微小RNA(miRNA)參與細胞增殖和凋亡,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要的調(diào)控作用。miRNA-21是最常見的表達上調(diào)miRNA,具有促進細胞增殖,抑制細胞凋亡,進而加速腫瘤生長轉(zhuǎn)移的作用。miRNA-21的這些作用,主要是通過調(diào)控程序性細胞死亡因子4(PDCD4)和抑癌基因(PTEN)及TPM1來實現(xiàn)[4-6]。由于上述促凋亡因子和抑癌基因與膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關,所以我們通過觀察重組腺病毒載體攜帶反義miRNA-21對膀胱癌T24細胞增殖和凋亡的影響,探索以miRNA-21為靶點治療膀胱癌的可能性。

圖3 TUNEL法檢測不同3組T24細胞凋亡率結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染反義rAV-miRNA-21的T24細胞增殖率降低,凋亡率增加與未轉(zhuǎn)染反義rAV-miRNA-21的空病毒組和空白對照組的T24細胞增殖率和凋亡率分別比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),而未轉(zhuǎn)染反義rAV-miRNA-21的兩組相比較,差異則無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。提示:①膀胱癌組織中存在miRNA表達失衡,對高表達miRNA-21的膀胱癌細胞,可以通過反義技術有效抑制;②利用miRNA-21模擬物或阻礙物,通過轉(zhuǎn)染腫瘤細胞可能有助于抑制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移。這為以miRNA-21為目標的膀胱癌靶向基因治療提供了新的初淺的實驗依據(jù)。

[1]Neely LA,RiegerChrist,Neto BS,et al.A microRNA expressionratio defining the invasive phenotype in bladder tumor[J].Urol Oncol,2008,15:155.

[2]Zhu S,Si ML,Wu H,et al.MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin[J].J Biol Chem,2007,19:14328.

[3]So A,Rocchi P,Gleave M.Antisense oligonucleotide therapy in the management of bladder cancer[J].CurrOpin Urol,2005,15:320.

[4]Li T,Li D,Sha J,et al.MicroRNA-21 directly targets MARCKS and promotes apoptosis resistance and invasion in prostate cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,383(3):280.

[5]Huang GL,Zhang XH,Guo GL,et al.Clinical signifcance of miRNA-21 expression in breast cancer[J].Oncol Rep,2009,21(3):673.

[6]Zhu S,Si ML,Wu H,et al.MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin1(TPM1)[J].J Biol Chem,2007,282(19):14328.

Recombinant adenovirus vector with antisense miRNA-21 affect bladder cancer cell growth

ZHU De-chun,LI Ran-wei,LIU Lu-cheng,et al.(Department of Urology,The Second Hospital of Jilin University,Changchun130041,China)

ObjectiveTo explore miRNA-21 antisense oligonucleotide mediated by recombinant adenovirus vector affect human bladder cancer cell line T24 growth.MethodsTo construct inverted insertion miRNA-21gene recombinant adenovirus vector(rAV-miR NA-21),and use rAV-miRNA-21 transfect T24,that is viral vector medication group.Adopting MTT and TUNEL detect proliferation and apoptosis status.Simultaneously set up control group and take vacancy viral group as comparison.ResultsThe T24 growth rates of rAV-miRNA-21group、control groupand vacancy viral group are(37.1±6.8)%,(95.7±5.8)%and(86.3±7.5)%,the apoptosis rates are(31.6±4.7)%,(8.4±2.9)%and(7.3±4.6)%.Compare proliferation and apoptosis of rAV-miRNA-21 group miRNA-21 groupwith control group and vacancy viral group,difference has statistical significance(P＜0.05),but between control group and vacancy viral group difference has nonsignificance(P＞0.05).ConclusionAntisense miRNA-21 recombinant adenovirus vector transfect T24 couldinhibit proliferation of tumor cell and increase tumor cell apoptosis,and so inhibit bladder cancer cell growth.

bladder cancer;miRNA-21;recombinant adenovirus;gene therapy

R735.14

A

1007-4287(2010)09-1351-03

國家自然科學基金資助課題(30972981)

朱德淳,53歲,男,碩士生導師,教授,主要從事泌尿腫瘤的早期診斷和治療研究。

2010-01-05)