李冰心 李婉雁 田允波

摘要[目的]研究亞硒酸鈉對小鼠脾臟淋巴細胞體外增殖及脾臟淋巴細胞中細胞因子分泌的影響，進而探討亞硒酸鈉調(diào)節(jié)機體免疫可能的作用途徑。[方法]從BALB/c小鼠脾臟中分離淋巴細胞，采用MTS法檢測不同濃度（0、10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L）的亞硒酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后的淋巴細胞增殖率并篩選出最適濃度的亞硒酸鈉進行脾臟淋巴細胞培養(yǎng)，最后采用ELISA法檢測培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)液中IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-6的分泌量。[結(jié)果]與對照組相比，10-7 mol/L亞硒酸鈉處理使淋巴細胞增殖率顯著提高，且培養(yǎng)液中IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-6的分泌量分別為對照組的10.34、2.15、1.06和6.68倍（P<0.05）。[結(jié)論]亞硒酸鈉可能通過調(diào)節(jié)脾臟淋巴細胞增殖和細胞因子的分泌來調(diào)節(jié)機體免疫功能。

關(guān)鍵詞亞硒酸鈉;小鼠;淋巴細胞;增殖率;細胞因子

中圖分類號S852.4文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0080-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.023

硒（selenium，Se）是維持動物健康的必需微量元素，在抗癌、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮著重要作用[1-4]。亞硒酸鈉作為無機硒的代表，是畜牧生產(chǎn)中常用的微量元素添加劑[5-8]。大量研究表明，硒提高機體免疫功能主要是通過其強大的抗氧化能力實現(xiàn)的。硒作為各種含硒酶類和硒蛋白的重要組成部分[9]，可通過增強氧化還原反應(yīng)、清除過多的脂質(zhì)過氧化物及氧自由基等有害物質(zhì)、保護細胞的結(jié)構(gòu)完整，進而增強機體抗氧化及免疫功能[10]。硒也具有直接促進免疫功能的生物學(xué)活性。硒能夠促進淋巴細胞增殖[8]，提高免疫細胞分泌細胞因子的能力[11]，從而直接調(diào)控機體免疫功能。硒還可以拮抗有害金屬造成的機體免疫抑制。硒通過與有害金屬結(jié)合形成金屬硒蛋白復(fù)合物，降低有害金屬毒性，減輕因有害金屬誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激及細胞功能障礙，增強體內(nèi)淋巴細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞等免疫細胞功能，從而調(diào)節(jié)機體免疫。上述研究揭示了硒對機體免疫功能的調(diào)節(jié)途徑及作用效果，但硒對體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細胞增殖及分泌細胞因子是否有直接的促進作用尚無定論。筆者選取不同濃度的亞硒酸鈉體外培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細胞，采用MTS法檢測不同濃度亞硒酸鈉對淋巴細胞增殖的影響，進而篩選出適宜的亞硒酸鈉濃度，并在此基礎(chǔ)上采用ELISA法檢測亞硒酸鈉對小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)液中IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-6含量的影響，以探索硒直接促進機體免疫功能的作用途徑。

1材料與方法

1.1試驗動物4周齡雌性BALB/c小鼠，購自南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物質(zhì)量合格證號為44005800004284，許可證號為SCKK（粵）2013-0034。

1.2主要試劑及耗材亞硒酸鈉購自德國SIGMA公司;小鼠脾臟淋巴細胞分離液購自北京康為世紀科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Thermo公司;植物血凝素（PHA）購自廣州市達輝生物技術(shù)有限公司;IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-6 ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司;MTS試劑盒購自美國Promega公司。

1.3脾臟淋巴細胞懸液的制備將小鼠安樂死后，無菌摘除脾臟，于200目細胞篩上垂直按壓，收集濾液。根據(jù)小鼠脾臟淋巴細胞說明書處理濾液，得到淋巴細胞懸液，將淋巴細胞懸液置于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)2 h，以去除貼壁細胞，收集細胞懸液得到純化的脾臟淋巴細胞，臺盼藍染色檢測結(jié)果顯示細胞活性為97%。根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，將細胞稀釋至終濃度1×106個/mL進行細胞培養(yǎng)。

1.4淋巴細胞培養(yǎng)及增殖率檢測在RPMI-1640完全培養(yǎng)液（10%血清、1%雙抗、1%谷氨酰胺）中加入無菌的亞硒酸鈉溶液，配制成亞硒酸鈉含量分別為0、10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L的體外細胞培養(yǎng)液。各處理組均設(shè)有刺激孔及對照孔，刺激孔中添加15 μg/mL PHA，然后將各組細胞分別接入96孔板中，每個濃度2個重復(fù)，每個重復(fù)9孔，37.0 ℃、5% CO2培養(yǎng)44 h，然后從每孔分別取100 μL細胞懸液至新96孔板中，加入20 μL MTS試劑，37.0 ℃避光孵育4 h，在波長490 nm處測定吸光值（OD值），按照細胞增殖率 = OD刺激孔/OD對照孔，計算不同硒含量處理組中淋巴細胞的增殖率。

1.5細胞因子檢測根據(jù)淋巴細胞增殖率結(jié)果，選取最適濃度的亞硒酸鈉培養(yǎng)液進行小鼠脾淋巴細胞體外培養(yǎng)。試驗分為硒處理組與對照組2組，培養(yǎng)48 h后 3 000 r/min離心5 min收集培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測上清液中IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-6的含量。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析試驗數(shù)據(jù)用平均值 ± 標準差（Mean±SD）表示。使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，細胞增殖率采用單因素方差分析LSD多重比較法;細胞因子結(jié)果采用獨立樣本t檢驗法。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度亞硒酸鈉對小鼠脾臟淋巴細胞增殖率的影響從圖1可以看出，與對照組相比，培養(yǎng)液中添加不同濃度的亞硒酸鈉均能顯著提高小鼠脾臟淋巴細胞增殖率（P<0.05），淋巴細胞增殖率隨著亞硒酸鈉的濃度降低而上升，當硒含量為10-7 mol/L時，淋巴細胞增殖率達到最大值且與其他試驗組均存在顯著差異（P<0.05），較對照組、10-5 mol/L亞硒酸鈉組、10-6 mol/L亞硒酸鈉組和10-8 mol/L亞硒酸鈉組分別提高了31.20%、15.09%、9.7%和4.9%;當亞硒酸鈉濃度為10-5和10-6 mol/L時，淋巴細胞增殖率較低，表明體外培養(yǎng)液中硒濃度與淋巴細胞增殖率之間存在量效關(guān)系。

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