許傳杰,劉林林,王貴全,何 旭,朱桂彬,李玉林*

(1.吉林大學第二醫(yī)院 病理科,吉林長春 130041;2.吉林大學第二醫(yī)院 放療科;3.吉林大學第二醫(yī)院科教科;4.吉林大學病理生物學教育部重點實驗室)

PEX基因在腫瘤細胞中的表達及其體外對微血管生成的影響

許傳杰1,劉林林2,王貴全3,何 旭4,朱桂彬4,李玉林4*

(1.吉林大學第二醫(yī)院 病理科,吉林長春 130041;2.吉林大學第二醫(yī)院 放療科;3.吉林大學第二醫(yī)院科教科;4.吉林大學病理生物學教育部重點實驗室)

目的探討PEX基因在體外對微血管生成的影響。方法利用RT-PCR、人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)小管形成實驗及雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管形成實驗,體外觀察PEX基因?qū)ρ苌傻挠绊?。結(jié)果穩(wěn)定篩選的細胞株BpcDNA-sPEX經(jīng)RT-PCR可擴增出sPEX帶;bFGF+BpcDNA-sPEX組小管數(shù)明顯少于bFGF+BpcDNA、bFGF+B16F10組(P＜0.01);bFGF+BpcDNA-sPEX組血管分支點數(shù)明顯少于bFGF+BpcDNA、bFGF+B16F10組(P＜0.01)。結(jié)論PEX基因能夠抑制由bFGF誘導的CAM血管的新生、PEX基因能夠阻抑bFGF對小管形成的促進作用。

PEX基因;RT-PCR;微血管生成

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0014)

Brooks等發(fā)現(xiàn)MMP-2可通過C端與整合素蛋白家族成員α vβ3結(jié)合,激活自身催化活性,產(chǎn)生 C端類血紅素結(jié)合片斷PEX(Hemopexin),該片斷可抑制MMP-2對ECM降解和血管的形成[1,2],提示PEX片斷有可能成為抗腫瘤血管生成新的生物活性藥物。目前對PEX基因的研究僅限于原核表達載體所表達的PEX融合蛋白對微血管生成的影響,因此本研究在構(gòu)建了真核表達載體pcDNA3.1-sPEX的基礎上,體外觀察PEX基因?qū)ξ⒀苌傻挠绊憽?/p>

1 材料與方法

1.1 穩(wěn)定篩選的細胞株BpcDNA-sPEX、BpcDNA獲得見已文獻[3]。B16F10細胞株購于中國科學院上海細胞生物研究所,以上三株細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2 TRIzol試劑分別提取BpcDNA-sPEX、BpcDNA、B16F10細胞總RNA,經(jīng)RT-PCR,觀察各個細胞株sPEX的表達情況,PCR反應條件為:94℃10 s、55℃30 s、72℃50 s,30個循環(huán),全部循環(huán)結(jié)束后,于72℃做5min終止前延伸。用GAPDH做內(nèi)對照。

1.3 HUVEC小管形成實驗 將Matrigel置4℃融化 ,包被于 24孔板內(nèi) ,每孔 320 μ l,37℃孵育30 min;生長狀態(tài)良好的HUVEC接種于Matrigel包被的24孔板內(nèi),每孔25 000個/75 μ l;各孔內(nèi)分別加入以下條件培養(yǎng)基:10%LSGS的M200培養(yǎng)液(對照組),bFGF,bFGF+BpcDNA-sPEX上清,bFGF+BpcDNA上清,bFGF+B16F10上清,各組bFGF的濃度均為30 ng/ml,37℃孵育30 min;加含10%低血清生長因子添加劑(LSGS)的 M200 培養(yǎng)液 150 μ l,37℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下孵育6 h;PBS洗細胞2次,每次5 min,4%多聚甲醛固定15 min;在倒置顯微鏡下觀察 、計數(shù) 。

1.4 CAM血管形成實驗 取9日齡雞胚,無菌H2O2洗凈,1/4 000甲醛擦拭后,涼干;將雞胚置檢卵燈下尋找胚頭,在距胚頭前1cm,兩條前卵黃靜脈之間的卵殼投影部位,用蠟筆畫出1 cm×1.5 cm長方形區(qū);在雞胚氣室端鉆約1.0 mm-2.0 mm小孔并穿透氣室殼膜;在蛋殼開窗位置,用75%酒精消毒后,用小銼刀沿長方形區(qū)的邊線磨切透卵殼(切勿傷及下方的卵殼膜);用眼科鑷夾住長方形卵殼膜,平行上提,暴露下方的卵殼膜;注射針頭循殼膜纖維方向劃破直徑1 mm小孔,不可傷及下方CAM;在殼膜窗上滴加無菌生理鹽水少許,然后用眼科鑷輕輕撥起小孔邊緣卵殼膜,讓液體浸入卵殼膜與CAM之間,CAM下沉后,剪除長方框內(nèi)卵殼膜;將直徑0.5 mm濾紙放置于CAM上無血管區(qū),在CAM上分別加入以下物質(zhì),依照加入物質(zhì)的不同而將實驗分成五組,A組:無菌生理鹽水;B組:30 μ g/ml bFGF;C組:30 μ g/ml bFGF+BpcDNA-sPEX 細胞上清;D組:30 μ g/ml bFGF+BpcDNA 細 胞上清 ;E 組:30 μ g/ml bFGF+B16F10細胞上清;用滅菌透明膠帶封住卵窗,放入恒溫箱內(nèi)孵育(37℃、濕度70%);72 h后,取出雞胚,局部滴加甲醇、丙酮等量混合固定液,室溫下固定15 min;待CAM上的血管內(nèi)血液凝固后,將測試區(qū)域的CAM剪下,置于盛有H2O2的碟皿中,用彎頭吸管展開后,傾去皿中的H2O2,在皿底攤平CAM,翻轉(zhuǎn)貼于濾紙上,記錄結(jié)果。在解剖顯微鏡下計數(shù)濾紙區(qū)域內(nèi)可見血管的分支點數(shù)量,統(tǒng)計學方法采用±s表示測定結(jié)果,平均數(shù)之間的比較采用方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定篩選的細胞株BpcDNA-sPEX、BpcDNA及親代細胞B16F10,經(jīng) RT-PCR,可見從BpcDNA-sPEX細胞中擴增出678 bp的 sPEX帶,而在BpcDNA、B16F10細胞中未擴增出目的基因,只見GAPDH帶。見圖1。

圖1 BpcDNA-sPEX細胞RT-PCR結(jié)果

2.2 PEX基因?qū)UVEC小管形成的影響

HUVEC在Matrigel膠包被的孔板內(nèi)可形成小管樣結(jié)構(gòu)。bFGF+PEX組小管形成的數(shù)量與bFGF+BpcDNA組、bFGF+B16F10組相比,統(tǒng)計學上存在著顯著差異(P＜0.01),bFGF+BpcDNA-sPEX組小管數(shù)明顯少于 bFGF+BpcDNA、bFGF+B16F10組;bFGF+BpcDNA組與bFGF+B16組相比,小管數(shù)量沒有明顯差別(P＞0.05)。見表1。

表1 不同組別HUVEC形成小管數(shù)量

2.3 PEX基因?qū)AM新生血管的抑制作用

在9日齡CAM上分別加入上述不同物質(zhì),72 h后可見:B組的血管分支點數(shù)明顯高于A組,C組的血管分支點數(shù)與B組相比,統(tǒng)計學上有著顯著性差異(P＜0.01),C組的血管分支點數(shù)明顯低于B組,D組和E組血管分支點數(shù)與B組相比,經(jīng)統(tǒng)計學處理沒有顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果見表2。

表2 不同組別CAM血管指數(shù)

3 討論

腫瘤生長和轉(zhuǎn)移是一個依賴于血管的過程,新生的血管將腫瘤細胞和微循環(huán)系統(tǒng)直接聯(lián)系起來,不僅使腫瘤生長的物質(zhì)交換得以進行,同時新生血管還可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移的通道。有實驗表明[4],原發(fā)腫瘤在血管形成前,腫瘤細胞是很少進入血液循環(huán),但在血管形成之后,入血的瘤細胞卻是持續(xù)的,進入血液的腫瘤細胞數(shù)與腫瘤血管密度密切相關。

血管新生是一個多種因子調(diào)控的復雜過程,正負兩類調(diào)節(jié)因子的相互作用決定了血管形成的全程,而此過程的最終結(jié)果是形成了新生的微血管。Ausprunk等人[5]曾利用電子顯微鏡對毛細血管的形成進行分析,發(fā)現(xiàn)在新的毛細管圍成環(huán)狀、新合成的細胞外基質(zhì)成分沉積、鋪墊后,血管環(huán)前端新合成的基底膜(BM)就開始了MMPs所介導的蛋白水解過程,內(nèi)皮細胞浸潤就從水解局部開始,形成一個新的毛細血管芽,隨后又接續(xù)了一系列細胞外蛋白水解的活化與抑制的動態(tài)循環(huán)過程。為了更直接地觀察MMPs對內(nèi)皮細胞形態(tài)變化方面的作用,研究人員采用了體外細胞培養(yǎng)[6],發(fā)現(xiàn)當將人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)于BM樣物質(zhì)(Matrigel)上時,內(nèi)皮細胞很快排成直線,圍成管狀,編織成血管網(wǎng)。用明膠酶譜分析檢測出培養(yǎng)上清中含有大量活化的MMP2與MMP9,額外添加這兩種酶的人工抗體,或TIMP1、TIMP2,發(fā)現(xiàn)人工抗體與組織抑制物的作用效果相似,均可降低甚至完全阻遏Matrigel上內(nèi)皮細胞管狀結(jié)構(gòu)的形成。為了明確PEX基因?qū)UVEC體外成管影響,我們設計了一組條件培養(yǎng)基對比實驗。實驗顯示:單純加入堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)能明顯促進小管的形成;bFGF+BpcDNA-sPEX上清組小管形成的數(shù)量與單純bFGF組相比有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01),bFGF+BpcDNA-sPEX上清組小管數(shù)明顯少于bFGF組;bFGF+BpcDNA、bFGF+B16上清組與單純bFGF組相比,小管形成數(shù)沒有明顯的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。說明bFGF能提高HUVEC形成小管的能力,而PEX基因可阻斷bFGF對HUVEC體外成管的促進作用。

有研究表明,在雞胚尿囊膜和兔角膜血管生成模型中,bFGF能引起αvβ3整合素的表達上升,誘導新生血管生成,用拮抗αvβ3整合素的單克隆抗體能抑制 αvβ3整合素誘導血管生成的反應,表明 αvβ3整合素參與bFGF誘導的血管生成[7]。我們在9日齡CAM上分別加入不同的作用物質(zhì),結(jié)果顯示:bFGF能促進CAM血管發(fā)生,而PEX基因能夠阻滯bFGF對CAM血管發(fā)生的促進作用。說明PEX基因不僅能抑制腫瘤血管生成,還阻滯雞胚絨毛尿囊膜血管新生。PEX是否與整合素αvβ3相互作用從而抑制了bFGF介導的雞胚絨毛尿囊膜新生血管的形成,還有待于進一步探討。

目前,抗血管生成治療腫瘤的研究多是先提純蛋白,再用于實驗,但蛋白的提取、純化等步驟較為繁瑣,且條件要求很高,原核表達的蛋白較難滿足實驗要求,因此本實驗首次在構(gòu)建了pcDNA3.1-sPEX真核表達載體的基礎上,體外觀察了PEX基因?qū)ξ⒀苌傻挠绊?為PEX片斷有可能成為抗腫瘤血管生成的新生物活性藥物奠定理論基礎和實驗依據(jù)。

[1]Brooks PC,Sillettl S,Von Schalscha TL,et al.Disruption of angiogenesi109pd by PEX,a noncatalytic metallopproteinase fragment with integrin binding activity[J].Cell,1998,92(3):391.

[2]李金萍,張光謀,柯 楊,等.基質(zhì)金屬蛋白酶-2 C端片段PEX的原核表達及其對血管發(fā)生的抑制作用[J].生物化學與生物物理進展,2002,29(1):120.

[3]許偉杰,李玉林,李一雷.基質(zhì)金屬蛋白酶-2 C端片斷pex的克隆,測序及真核表達的構(gòu)建[J].吉林大學學報(醫(yī)學版),2003,29(5):591.

[4]Giobron MA,Cotran RS,Leapman,et al.Tumor growth and neovascularization:An experimental model using rabbit cornea[J].J Natl Cancer Inst,1974,72(5):413.

[5]Ausprunk DH,Folkman J.Migration and proliferation of endothelial cells in performed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis[J].Microvasc Res,1977,14:53.

[6]Goede V,Schmidt T,Kimmina S,et al.Analysis of blood vesselmaturation processes during cyclic ovarian angiogenesis[J].Lab Invest,1998,78:1385.

[7]Montgomery AM,Reisfeld RA,Cheresh DA.Integrin alpha v beta 3 rescues melanoma cells from apoptosis in three-dimensional dermal collagen[J].J Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:8856.

expression of PEX genes in thetumor cell and effect on microvascular formation in vitro

XU Chuan-jie,LIU Lin-lin,WANG Gui-quan,et al.(Dept.of Pathology,The Second Hospital Jilin University,Changchun130041,China)

ObjectivePurpose To approach the possible effects of PEX genes on microvascular formation in vitro.MethodsUsing RT-PCR,matrigel capillary-like tube structure formation assay on human umbilical vein endothelial cells(HUVEC),and chick chorioallantoic membrane(CAM)assay methods to examine the effects of PEX genes on microvascular formation in vitro.ResultsRT-PCR results indicated that sPEX m RNA expressed in the BpcDNA-sPEX-positive cell line.with bFGF+BpcDNA or bFGF+B16F10 treatment,bFGF+BpcDNA-sPEX treatment not only induced a significantly decrease in the amount of capillary-like tube(P＜0.01)but also resulted in a significantly decrease in the amount of branch vessels(P＜0.01).ConclusionPEX genes can inhibit bFGF-induced CAM vascular neogenesis,and prevent bFGF-induced enhancement inmatrigel capillary-like tube structure formation.

PEX gene;RT-PCR;microvascular formation

Q78

A

1007-4287(2010)01-0014-03

*通訊作者

許傳杰,40歲,女,博士,副教授,主要研究方向:腫瘤分子病理學。

2008-03-09)