王 鵬,于金明,朱玉存,程勛全,楊渭川,葛 銳,王自勇,喬飛飛

(1.合肥仁濟(jì)腫瘤醫(yī)院伽瑪?shù)堆芯恐行?安徽合肥 230022;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院山東省腫瘤防治院放療科;3.安徽省立醫(yī)院放射治療科)

大鼠正常腦組織伽瑪?shù)墩丈浜驧RI表現(xiàn)及GFAP表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

王 鵬1,2*,于金明2,朱玉存1,程勛全3,楊渭川1,葛 銳1,王自勇1,喬飛飛1

(1.合肥仁濟(jì)腫瘤醫(yī)院伽瑪?shù)堆芯恐行?安徽合肥 230022;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院山東省腫瘤防治院放療科;3.安徽省立醫(yī)院放射治療科)

目的研究伽瑪?shù)?Gamma knife)照射大鼠尾狀核后膠原纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)隨時(shí)間的變化,探討星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖與放射損傷的關(guān)系以及放射性損傷的影像學(xué)表現(xiàn)。方法40只成年雌性Wistar大鼠,10只大鼠作為對(duì)照組。30只大鼠接受MASEP-SRRS型伽瑪?shù)? mm準(zhǔn)直器以50 Gy(50%等劑量線)照射大鼠右側(cè)尾狀核。照射后的30只大鼠隨機(jī)分為3組,每組10只。不同組別的大鼠分別在照射后第1,4,12周深度麻醉下斷頭取出腦組織,行免疫組織化學(xué)染色觀察GFAP的表達(dá),并使用梯度柱法測(cè)量腦組織的比重。大鼠處死前接受1.5 T MRI軸位平掃和增強(qiáng)掃描。結(jié)果MRI提示照射后第12周可發(fā)現(xiàn)受照大鼠尾狀核T2相可見(jiàn)受照區(qū)信號(hào)增高,增強(qiáng)T1相可見(jiàn)受照區(qū)強(qiáng)化明顯。對(duì)照組大鼠腦組織內(nèi)均勻散在分布少數(shù)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞,輪廓清楚,星形突起纖細(xì)。照射后4周靶區(qū)內(nèi)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目開(kāi)始增多,細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則。至12周時(shí)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)一步增多,胞體變大,細(xì)胞突起粗大不規(guī)則,胞漿染色呈深棕色。照射后第4周和第12周檢測(cè)到照射側(cè)腦組織比重與對(duì)側(cè)相比顯著減輕。結(jié)論GFAP可作為衡量腦放射性損傷的指標(biāo)。照射后早期即出現(xiàn)腦水腫反應(yīng)和血腦屏障破壞。在不同時(shí)間點(diǎn)的病理變化可以通過(guò)MRI信號(hào)觀察不同時(shí)間點(diǎn)的病理變化。

膠質(zhì)纖維酸性蛋白;中樞神經(jīng)系統(tǒng);放射損傷

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0023)

本研究旨在建立伽瑪?shù)斗派湫該p傷的大鼠動(dòng)物模型,探討正常腦組織受伽瑪?shù)墩丈浜笤诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)腦組織膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及腦組織水含量變化,以及MRI影像學(xué)改變,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及主要實(shí)驗(yàn)儀器 成年健康雌性Wistar大鼠40只,體重300-400g?，斘髌?深圳)醫(yī)學(xué)科技有限公司生產(chǎn)MASEP-SRRS型伽瑪?shù)?焦點(diǎn)吸收劑量率 1.5 Gy/min,運(yùn)用MASEP Superplan 2.0劑量計(jì)劃系統(tǒng)進(jìn)行劑量計(jì)劃設(shè)計(jì)。影像定位采用Siemens 1.5 Tesla超導(dǎo)MRI。用自制高強(qiáng)度有機(jī)玻璃大鼠立體定向放射外科固定裝置與Leksell立體定向儀框架及適配器相配合。抗體及免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中山公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠在10%水合氯醛(3 ml/Kg體重i.p)麻醉下固定于伽瑪?shù)读Ⅲw動(dòng)物定位頭架上,用Siemens 1.5 Tesla超導(dǎo)MRI行大鼠大腦橫軸薄層連續(xù)掃描,所得影像資料輸入計(jì)算機(jī)工作站,將治療靶點(diǎn)的位置確定于大鼠(n=30只)右側(cè)尾狀核,采用8 mm準(zhǔn)直器對(duì)大鼠腦組織實(shí)施照射,等劑量曲線50%,周邊劑量50 Gy,中心劑量100 Gy。照射組(n=30只)行伽瑪?shù)墩丈?并隨機(jī)分為3組,每組10只,擬分別于第1周末,第4周末和第12周末處死。對(duì)照組(n=10只)未行伽瑪?shù)墩丈?。伽瑪?shù)吨委熀蟠笫蟪Ｒ?guī)飼養(yǎng),避光、溫暖、給予充分的水和食物,觀察大鼠的活動(dòng)、精神狀況、飲食以及體重等。大鼠在處死前使用1.5 T MRI觀察影像學(xué)變化(橫軸)。在第1、4、12周末的時(shí)間點(diǎn)分別將各組大鼠處死,在10%水合氯醛深度麻醉下,開(kāi)胸經(jīng)左心室升主動(dòng)脈插管先以100 ml生理鹽水沖洗血液,隨后用冷的(4℃)含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液液灌注固定,取出腦組織,標(biāo)本于10%福爾馬林中固定24小時(shí),免疫組化采用SP法,陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.3 圖像分析 切片經(jīng)圖像分析儀(Quantimet 570C,Leica)處理。GFAP陽(yáng)性細(xì)胞面積測(cè)定選擇對(duì)照組大鼠及照射組大鼠的照射側(cè)和對(duì)照側(cè)尾狀核,在10(目鏡倍率)×20(物鏡倍率)倍率下,任選5個(gè)視野,計(jì)數(shù)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4 腦組織比重的測(cè)定 在大鼠雙側(cè)大腦半球尾狀核各取5-10 mg腦組織,以梯度柱法測(cè)定腦組織的比重。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察 各組動(dòng)物在觀察期間無(wú)一死亡,但攝食減少,活動(dòng)稍減少,皮毛顯不潔,發(fā)黃,體重減輕。

2.2 大鼠照射后MRI變化 大鼠在第1、4、12周行頭顱MRI檢查,在第12周再次行MRI檢查可見(jiàn)T2WI可見(jiàn)受照靶區(qū)呈高信號(hào),結(jié)構(gòu)有破壞,增強(qiáng)TIWI可見(jiàn)受照靶區(qū)有強(qiáng)化。第1、4周末影像學(xué)未見(jiàn)有T2WI高信號(hào),增強(qiáng)T1WI未見(jiàn)有強(qiáng)化。見(jiàn)圖1、2。

2.3 GFAP免疫組織化學(xué)染色觀察 正常對(duì)照組大鼠腦相當(dāng)于靶組織內(nèi)均勻散在分布少數(shù)的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞輪廓清楚,星狀突起纖細(xì),為星形細(xì)胞。GFAP分布于星形細(xì)胞胞漿及星狀突起中,為棕黃色顆粒。照射后4周靶區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞散在分布,輪廓清楚,星狀突起纖細(xì),形態(tài)、數(shù)目較對(duì)側(cè)及對(duì)照組顯著增加。照射后12周右側(cè)尾殼核區(qū)域內(nèi)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較對(duì)側(cè)及假照射組顯著,可見(jiàn)神經(jīng)元腫脹,增多,胞體變大,胞漿顏色較深。見(jiàn)圖3、4,表1、2。

2.4 腦組織比重的測(cè)定 大鼠正常大腦的腦比重為1.047,照射后1周的腦比重為1.044,照射后4周的腦比重為1.036,照射后12周的腦比重為1.035。伽瑪?shù)墩丈浜蟮?周和第12周腦組織比重明顯低于正常對(duì)照組和照射前水平(P＜0.05)。對(duì)側(cè)腦組織比重的變化各組間無(wú)顯著差異。

圖1 第12周增強(qiáng)T1WI可見(jiàn)大鼠尾狀核強(qiáng)與對(duì)側(cè)形成對(duì)比

圖2 第12周T2WI可見(jiàn)大鼠 尾狀核呈高信號(hào),高于對(duì)側(cè)尾狀核

圖3 照射后4周靶區(qū)GFAP 陽(yáng)性細(xì)胞散在分布,輪廓清楚,星狀突起纖細(xì)形態(tài)、數(shù)目較對(duì)側(cè)及對(duì)照組顯著增加(10×20倍)

圖4 照射后12周右側(cè)尾殼核區(qū)域內(nèi)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較對(duì)側(cè)及假照射組顯著,可見(jiàn)神經(jīng)元腫脹,增多,胞體變大,胞漿顏色較深(10×20倍)

表1 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)組內(nèi)比較(n=10)

表2 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)組間比較(n=10,t檢驗(yàn))

3 討論

星形細(xì)胞是哺乳動(dòng)物大腦內(nèi)分布最廣且具有十分重要的功能,許多研究表明它與神經(jīng)系統(tǒng)大多數(shù)疾病發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。作為細(xì)胞骨架主要成分的正常情況下,腦內(nèi)GFAP少有表達(dá),中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時(shí)發(fā)生GFAP水平上調(diào),是星形膠質(zhì)細(xì)胞最常見(jiàn)的特征性反應(yīng),GFAP不但是星形細(xì)胞在細(xì)胞水平的特異性標(biāo)記物,而且已成為病理情況下敏感的生化指標(biāo)之一[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種類型損傷均可引起星形細(xì)胞的反應(yīng),使星形細(xì)胞由常態(tài)轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性星形細(xì)胞,表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目增加、細(xì)胞體肥大,星形膠質(zhì)細(xì)胞分支增多,并且GFAP的表達(dá)增強(qiáng)。因此GFAP可以作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷范圍及預(yù)后的生化標(biāo)志物。

魏銘等[2]進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞學(xué)伽瑪?shù)墩丈涞碾x體研究,給予膠質(zhì)瘤細(xì)胞4-36 Gy伽瑪?shù)墩丈浜蟀l(fā)現(xiàn):原代培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)伽瑪?shù)墩丈浜驡FAP表達(dá)增高,呈劑量依賴性增高,即隨放射劑量的提高GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加更加明顯,并且作者認(rèn)為與縫隙連接蛋白-43(Cx-43)的異常低表達(dá)有關(guān)。

本研究選擇大鼠右側(cè)尾殼核作為照射靶點(diǎn),研究的時(shí)間點(diǎn)選擇照射后第1,4,12周,希望詳細(xì)地了解照射后3個(gè)月內(nèi)GFAP的動(dòng)態(tài)變化,而前3個(gè)月的期限恰好是放射外科治療并發(fā)癥出現(xiàn)前的潛伏期,參照文獻(xiàn)[3]的我們的實(shí)驗(yàn)劑量采用50 Gy,揭示了CNS在接受50 Gy照射后在第1周后沒(méi)有顯著變化,第4周檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)GFAP表達(dá)增多并且隨著時(shí)間的推移星形細(xì)胞不斷增多,細(xì)胞逐漸肥大,細(xì)胞突粗大不規(guī)則;照射12周后GFAP表達(dá)和細(xì)胞學(xué)形態(tài)改變進(jìn)一步顯著增加。這和Kamiro和楊婷等的報(bào)道是一致的。Kamiro等[4]研究伽瑪?shù)墩丈浯笫竽X組織后的組織學(xué)變化,他們運(yùn)用4 mm準(zhǔn)直器照射大鼠右側(cè)頂葉皮質(zhì),給與120Gy的劑量后一天即發(fā)現(xiàn)GFAP染色增強(qiáng),星形細(xì)胞出現(xiàn)肥大,在第4周時(shí)最為明顯。在給予50 Gy劑量時(shí),他們觀察了1,3,6,9,12個(gè)月這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn),發(fā)現(xiàn)在照射后一個(gè)月GFAP表達(dá)呈“±”,至三個(gè)月時(shí)呈陽(yáng)性表達(dá)。楊婷等[5]同樣應(yīng)用4 mm準(zhǔn)直器照射大鼠尾殼核前部,90 d后取腦組織作免疫組化研究,研究不同放射劑量照射后GFAP的表達(dá)和星形細(xì)胞的變化,發(fā)現(xiàn)隨著放射劑量的增高反應(yīng)性星形細(xì)胞的數(shù)量和GFAP的表達(dá)愈加升高。

本研究在伽瑪?shù)墩丈浜蟛煌瑫r(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行了MRI影像學(xué)檢查。大鼠在照射后第12周行MRI檢查提示有影像變化,表現(xiàn)為:在T2WI上表現(xiàn)為尾狀核區(qū)不均勻高信號(hào),T1WI相沒(méi)有顯著改變,增強(qiáng)T1WI上表現(xiàn)為尾狀核的增強(qiáng),而在第1、4周末沒(méi)有提示有MRI影像學(xué)的顯著改變,我們推測(cè)腦組織接受電離輻射后血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞和死亡,造成血腦屏障導(dǎo)致血液中的增強(qiáng)劑量進(jìn)入瘤體,并且伴隨有尾狀核細(xì)胞的死亡。星形膠質(zhì)細(xì)胞是組成血腦屏障的一類細(xì)胞,它伸出的足樣投射幾乎完全包繞著血腦屏障的毛細(xì)血管,在維持血腦屏障功能方面起著重要作用[6]。王璐等[7]作了關(guān)于GFAP表達(dá)與血腦屏障的相關(guān)性研究,發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重燙傷后GFAP表達(dá)增加、血腦屏障的通透性增高,該作者認(rèn)為腦內(nèi)GFAP對(duì)維持血腦屏障功能的完整性具有重要作用,其表達(dá)水平的增加可能標(biāo)志著血腦屏障的破壞,故作者推測(cè)星形細(xì)胞的反應(yīng)性增生與血腦屏障損害,繼發(fā)性腦水腫有關(guān)。大鼠尾狀核伽瑪?shù)墩丈浜驧RI掃描血腦屏障打開(kāi)是否也存在類似機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,50Gy對(duì)大鼠尾狀核照射后,星形細(xì)胞增生肥大,GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增多且隨著照射后時(shí)間的延長(zhǎng)而更加明顯,并且伴隨者大腦比重的降低,提示GFAP可作為伽瑪?shù)墩丈浜蠓派湫該p傷的指標(biāo)。大鼠大腦照射后組織破壞,血腦屏障打開(kāi),在1.5T MRI表現(xiàn)為T2WI高信號(hào),增強(qiáng)T1WI有較明顯的強(qiáng)化。

[1]Gomes FC,Paulin D,Moura-Neta V.Glial fibrillary acidic protein(GFAP):modulation bygrowth factors and its implication in astrocyte differentiation[J].Braz J Med Biol Res,1999,32(5):619.

[2]魏 銘,徐德生,張建寧,等.伽瑪?shù)墩丈浜竽z質(zhì)細(xì)胞Cx43和GFAP表達(dá)及意義[J].國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科雜志,2009,36(1):1.

[3]Kamiryo T,Kassell NF,Thai QA,et al.Histological changes in the normal rat brain after gamma irradiation[J].Acts Neurochi(Wien),1996,138:451.

[4]Kamiryo T,Kassell NF,Thai QA,et al.Histological changes in the nor mal rat brain after gamma irradiation[J].Acts Neurochi(Wien),1996,138:451.

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An experimental study on the expression of glial fibrillary acidic protein and MRI imaging changes in the normal Wistar rat brains after Gamma knife radiosurgery

WANGPeng,YU Jin-ming,ZHU Yu-cun,et al.(Department of Gamma Knife Center,Hefei Renji Cancer Hospital,Hefei230022,China)

ObjectiveTo explore the time-related expression of GFAP andMRI imaging changes in the normal rat brain during the subacute phase after Gamma knife irradiationy.Methods40 adult female Wistar rats were were enrolled into the study.Ten rats served as controlled group while the other thirty rats underwent Gamma knife.The right caudate-putamen nucleus was selected as the target of irradiation.A 8 mm collimator was used to transmit 50 Gy to the target region.Ratswere killed 1st,4thand 12ndweeks after gamma knife irradiation.GFAP were detected by avidin-biotin complex technique.And serial MRI imaging were obtarined at 1st,4thand 12ndweeks.And specific gravity of the brain were also obtained.ResultsThe number of GFAP positive cells(astrocytes)in the target region 1stweek after irradiation was not statistically different from that of the control group.GFAP positive cellsin the target region gradually increase in the 4thand12ndweeks after irradiation comparedwith the sham group.The shape of astrocytesbecame irregularly over time.The specific gravity decreased during the 4thand 12ndweek.High signalwere found on MRI scans by T2WI and enhanced T1WI serials.ConclusionActive astrocytosismay play an important role in the pathological changesin the normalbrain after Gamma knife radiosurgery.SerialMRI scan can observed the pathological changes by signal changes.

GFAP;Central nervous system;Radiation injury

R651.1;R814.42

A

1007-4287(2010)01-0023-04

衛(wèi)生部課題(WKJ 2005-3-006)

*通訊作者

王鵬,男,博士,研究方向:腫瘤精確放射治療、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的放射外科治療以及正常組織的放射性損傷研究。

2009-04-07)