杜文彥,王景宏,劉欽毅,鄭長軍*

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 骨科,黑龍江 佳木斯 154002;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 骨科,吉林 長春 130041)

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

杜文彥1,王景宏1,劉欽毅2,鄭長軍2*

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 骨科,黑龍江 佳木斯 154002;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 骨科,吉林 長春 130041)

目的應(yīng)用膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)基因轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞,觀察GDNF基因在雪旺氏細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效果,以及對(duì)雪旺氏細(xì)胞的營養(yǎng)作用。方法將雪旺氏細(xì)胞分為空白對(duì)照組、載體組、空載體組,通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo),將GDNF基因轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞。用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)、免疫組化、流式細(xì)胞儀觀察在 24 h、48 h、72 h各組轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞的營養(yǎng)作用。結(jié)果在載體組細(xì)胞的生長狀況較其他兩組增殖良好。免疫組化可見GDNF在載體組細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)。流式細(xì)胞儀觀察基因轉(zhuǎn)染后對(duì)雪旺氏細(xì)胞有明顯的營養(yǎng)作用。結(jié)論GDNF基因轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞后,在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá),并對(duì)細(xì)胞有明顯的營養(yǎng)作用。

雪旺氏細(xì)胞;膠質(zhì)神經(jīng)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)基因;轉(zhuǎn)染

Q785

A

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0020)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病,神經(jīng)損傷后可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡、局部瘢痕形成等一系列病理變化。神膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及雪旺氏細(xì)胞對(duì)神經(jīng)損傷后的修復(fù)起到重要作用,但是二者單獨(dú)應(yīng)用于神經(jīng)損傷的修復(fù)治療有其局限性,我們將膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)基因?qū)胙┩霞?xì)胞,觀察GDNF的表達(dá)和對(duì)細(xì)胞的營養(yǎng)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

雪旺氏細(xì)胞(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室提供)。倒置顯微鏡(OLYMPUS公司);離心機(jī)(長沙湘儀公司);流式細(xì)胞儀(BD公司);高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司);-80℃冰箱(三洋公司)。MTT(Sigma公司);DMEM(GIBCO公司);GDNF抗體(ADL公司);SP免疫組化試劑盒(福州邁新公司);LipofectamineTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Gibco公司)

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-N1/GDNF和質(zhì)粒pEGFP-N1分別通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入純化培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組,以觀察SCs的GDNF的表達(dá)情況。其中空白對(duì)照組:不做轉(zhuǎn)染的SCs;空載體組:將質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染導(dǎo)入SCs;實(shí)驗(yàn)組:將重組質(zhì)粒pEGFP-N1/GDNF轉(zhuǎn)染SCs。

1.2.2 質(zhì)粒的制備 將攜帶實(shí)驗(yàn)組和空載體組的質(zhì)粒接種在含有選擇抗菌素的平皿上,培養(yǎng)成功后,在兩組分別取出100 U至20 ml的LB液體培養(yǎng)基中,在37℃過夜震蕩培養(yǎng)16-18小時(shí)。將培養(yǎng)好的菌液收集于離心管內(nèi),于4℃5 000 rpm離心15 min,棄上清。加0.1倍體積3 M醋酸鈉(pH4.6)混勻后冰浴靜止放置30 min以上。于4℃4 000 rpm離心15 min,棄上清。加無DNA酶的RNA酶(10 mg/ml)于上清液中,在37℃下培養(yǎng)30min。加等體積的酚:氯仿:異丙醇(25∶24∶1)混合液搖勻,于 4℃5 000 rpm離心10 min,加等體積95%乙醇,-20℃下放置30 min,于20℃5 000 rpm離心10 min,棄上清。加入等體積13%聚乙二醇溶液8 000(1.6 M/NaCl),在4℃下靜置過夜。離心10 min,4℃下10 000 rpm,棄上清。用70%冷乙醇洗滌并抽干,于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雪旺細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存管中的SC,放入37℃恒溫水箱迅速復(fù)溫,并不斷搖動(dòng),使之迅速融化,待融化后,轉(zhuǎn)移至75 ml培養(yǎng)瓶內(nèi),800 r/min離心5 min,棄上清。加入含10%高糖DMEM培養(yǎng)基至5 ml,在37℃,含 5%CO2的飽和濕度的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,更換新鮮培養(yǎng)液。待貼壁細(xì)胞達(dá)80%-90%左右時(shí)采用胰酶消化法按1∶4傳代,觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí),準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。

1.2.4 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,胰酶消化,調(diào)細(xì)胞濃度為2×105,分別接種于6孔培養(yǎng)板,每孔2 ml。置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁,培養(yǎng)6-24小時(shí)。觀察細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí),進(jìn)行下列操作。取一Ep管,空載體組與載體組分別取5 μ g質(zhì)粒,加無血清、無抗生素培養(yǎng)基至97 μ l,空白對(duì)照組直接加無血清、無抗生素培養(yǎng)基至 97 μ l,取 3 μ l脂質(zhì)體加入到上述混合液中。振蕩混勻或漩渦混勻2 s,室溫孵育15 min。用無血清、無抗生素培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次,加無血清、無抗生素培養(yǎng)基,將上述混合液加至培養(yǎng)液表面,充分混勻,注意不能濺到培養(yǎng)板蓋上。8小時(shí)后,更換完全培養(yǎng)基。72小時(shí)后熒光顯微鏡檢測(cè)

1.3 觀察指標(biāo)

倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果;用MTT方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長情況;用免疫組化觀察轉(zhuǎn)然后的雪旺氏細(xì)胞中的GDNF表達(dá)情況;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的細(xì)胞周期,觀察細(xì)胞增殖情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用Excel軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理,每兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞效果

轉(zhuǎn)染24 h后開始行倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)強(qiáng)度。轉(zhuǎn)染24 h后,可見空白對(duì)照組未見熒光細(xì)胞表達(dá)。空載體組和載體組雪旺細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光。至培養(yǎng)72 h,高倍顯微鏡下可見空載體組和載體組綠色熒光亮度增強(qiáng)(圖1),表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果較好。

圖1 倒置顯微鏡下質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SCs細(xì)胞的熒光表達(dá)

2.2 MTT檢測(cè)結(jié)果

在用MTT方法檢測(cè)三組(空白對(duì)照組、空載體組、載體組)細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的生長狀況顯示:24小時(shí)時(shí)細(xì)胞生長狀況無明顯的變化,48小時(shí)空載體組細(xì)胞數(shù)減少,這說明單純的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用。在72小時(shí)載體組的細(xì)胞數(shù)量與空白對(duì)照組及空載體組比較有明顯差異(P＜0.01)。說明GDNF轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞對(duì)細(xì)胞有明顯的營養(yǎng)作用,見表1。

2.3 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

免疫組化染色72小時(shí)后鏡下觀察顯示:空白對(duì)照組和空載體組SCs胞漿內(nèi)有淺棕色免疫復(fù)合物沉積,而載體組的SCs中胞漿內(nèi)有深棕色免疫復(fù)合物沉積(圖2),表明GDNF基因在SCs中成功表達(dá),且載體組GDNF的表達(dá)較空白對(duì)照組和空載體明顯增多。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

在用流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)三組(空白對(duì)照組、空載體組、載體組)細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的 S期細(xì)胞增殖情況見表2。

表1 不同時(shí)間各組細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

圖2 鏡下質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SCs細(xì)胞的免疫組化圖

表2 不同時(shí)間各組流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

3 討論

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)是由1993年Lin等[1]首先發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)因子,是從大鼠膠質(zhì)細(xì)胞系B49的無血清培養(yǎng)基中經(jīng)濃縮、分離純化出來的。初期研究發(fā)現(xiàn)GDNF對(duì)中腦的多巴胺能神經(jīng)元有較高的營養(yǎng)作用,隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)GDNF家族成員對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有營養(yǎng)作用。可以阻止體內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退變,對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元起保護(hù)作用[2]。通過實(shí)驗(yàn)研究表明,GDNF是現(xiàn)階段神經(jīng)營養(yǎng)因子中作用最強(qiáng)的[3-5]。GDNF基因已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于神經(jīng)損傷后的修復(fù)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中。實(shí)驗(yàn)證明了由于腦脊屏障的存在,單純的GDNF治療受到明顯限制。

雪旺氏細(xì)胞(Schwann cells,SCs)可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子,在周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)中具有重要作用。雖然雪旺氏細(xì)胞對(duì)神經(jīng)損傷的修復(fù)有較強(qiáng)的營養(yǎng)作用,但是單純雪旺氏細(xì)胞移植治療很難穿越星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的瘢痕區(qū)域。這是由于單純SC移植神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌量不足、且分泌具有時(shí)效局限性及在損傷脊髓的膠質(zhì)瘢痕中存活不良所致,因此單純SC移植治療神經(jīng)損傷很難達(dá)到理想的效果。

在我們的實(shí)驗(yàn)中,我們通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo),將膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)入雪旺氏細(xì)胞中,形成基因修飾的雪旺氏細(xì)胞,觀察基因在雪旺氏細(xì)胞中的表達(dá)效果以及神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)雪旺氏細(xì)胞的營養(yǎng)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過陽離子脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pEGFP-N1/GDNF轉(zhuǎn)入雪旺氏細(xì)胞中,能夠高效表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子,表達(dá)的神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)雪旺氏細(xì)胞具有明顯的營養(yǎng)作用,對(duì)進(jìn)一步應(yīng)用基因修飾的雪旺氏細(xì)胞移植治療脊髓損傷打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。相信隨著相關(guān)研究的深入,脊髓損傷治療的效果能夠得到進(jìn)一步提高。

[1]Lin LF,Doherty DH,Lile JD,et al.GDNF:a glial cell line derived neurotrophic factor for midbrain dopaminerigic neurons[J].Science,1993,260(5111):1130.

[2]Milbrandt J,Desauvage FJ,Fahrner TJ,et al.Persephin,a Novel Neurotrophic Factor Related to GDNF and Neurtuin[J].Neuron,1998,20:245.

[3]Kasahara K,Nakagawa T,Kubota T.Neuronal loss and expression of neurotrophic factors in a model of rat chronic compressive spinal cord injury[J].Spine,2006,1531(18):2059.

[4]Lim PA,Tow AM.Recovery and regeneration after spinal cord injury:a review and summary of recent literature.Ann Acad Med Singapore[J].2007,36(1):49.

[5]Macias MY,Syring MB,Pizzi MA,et al.Pain with no gain:allodynia following neural stem cell transplantation in spinal cord injury[J].Exp Neurol,2006,201(2):335.

The Experimental Study of Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor Gene Transfection to Schwann Cells

DU Wen-yan,WANGJing-hong,LIU Qin-yi,et al.(The OrthopedicsDepartment of theFirst Hospitalof JiamusiUniversity,Jiamusi154002,China)

ObjectiveTo observe the expression of GDNF and the role of nutrition and protection in Schwann cells through GDNF gene's transfetion to Schwann cells.MethodsThe Schwann cells were divided into control group,empty vector group,vector group.The GDNF gene was transfected into Schwann cellsthrough cationic liposome mediattion.The nutritional function and expression effectwere examined thoughMTT,immunohistochemistry,flow cytometry at 24 h,48 h,72h after transfection of eachgroup.ResultsThe cells in vector group were more proliferated and vigorous than the other two groups in MTT;Immunohistochemistry showed high expression of GDNF in vector group;There were obvious nutritional role of transfectedGDNF gene on Schwann cells in flow cytometry.ConclusionAfter GDNF gene transfection to Schwann cells,there were high expression of GDNF gene which had obvious nourishing and protective effects on Schwann cells.

Schwann cells;Glial-derived neurotrophic factor;transfection

1007-4287(2010)01-0020-03

吉林省科技廳資助課題,課題編號(hào)為200705222

*通訊作者

2009-05-22)