陳芳芳,王軼楠,汪 麗,孟小丹,孫 洋,柳忠輝*

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,吉林省神經(jīng)免疫與臨床免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

血清卵泡抑素水平檢測(cè)用于卵巢癌診斷的研究

陳芳芳1,王軼楠1,汪 麗2,孟小丹1,孫 洋1,柳忠輝1*

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,吉林省神經(jīng)免疫與臨床免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

目的探討卵泡抑素在卵巢癌患者血清中的水平變化及其臨床意義。方法采用ELISA法檢測(cè)腫瘤患者及健康對(duì)照者血清FS水平;免疫組織化學(xué)染色觀察卵巢癌組織FS表達(dá)情況。結(jié)果卵巢癌患者血清FS水平明顯高于健康對(duì)照組,統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異顯著,P＜0.01;乳腺癌和肺癌患者血清FS水平也高于健康對(duì)照組,P＜0.05;胃癌和腎癌患者血清FS水平與健康對(duì)照組比較無顯著性差異,P＞0.05。腫瘤診斷陽(yáng)性率依次為卵巢癌(60%)＞乳腺癌(40%)＞肺癌(30%)＞胃癌(20%)＞腎癌(0%)。免疫組織化學(xué)染色顯示,卵巢癌組織表達(dá)FS與腫瘤類型有關(guān),染色強(qiáng)度依次為粘液性癌＞子宮內(nèi)膜樣癌＞透明細(xì)胞癌＞鱗癌＞漿液性癌。結(jié)論卵巢癌患者血清FS水平升高,其診斷陽(yáng)性率與卵巢腫瘤類型有關(guān);血清FS檢測(cè)對(duì)卵巢癌診斷具有重要價(jià)值。

卵泡抑素;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn);卵巢癌;診斷

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0207)

卵泡抑素(Follistatin,FS),又稱激活素結(jié)合蛋白,是一種單鏈糖蛋白,最初從豬和牛的卵泡液中分離獲得,具有抑制垂體前葉腺細(xì)胞分泌卵泡刺激素(FSH)作用[1,2]。對(duì)FS的生物學(xué)活性及其與疾病的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),FS作為激活素特異結(jié)合蛋白參與體內(nèi)多種生理、病理功能的調(diào)節(jié),如在早期胚胎發(fā)育、卵巢顆粒細(xì)胞分化、肝纖維化、多卵巢綜合征等疾病的形成中均具有重要的作用[3,4]。FS不僅在性腺組織表達(dá),在外周血中也能檢測(cè)到FS成熟蛋白的分泌,血清中FS水平變化與女性妊娠以及腫瘤等有關(guān)[5,6]。為了明確FS與卵巢腫瘤的關(guān)系,本研究通過檢測(cè)卵巢癌患者外周血FS水平變化,以及FS在卵巢癌組織中的表達(dá),進(jìn)而闡述FS在臨床診斷卵巢癌中的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 FS標(biāo)準(zhǔn)蛋白來自中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)的重組人FS288,由日本德島大學(xué)新谷保實(shí)先生提供。

1.2 研究對(duì)象 選擇自2005年1月至2007年6月在吉林大學(xué)第一、二臨床醫(yī)院住院的經(jīng)病理和細(xì)胞學(xué)診斷證實(shí)的腫瘤患者(卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、腎癌)。

1.3 血清樣本處理 血清采自患者入院后第二日晨時(shí)空腹靜脈血,經(jīng)3 000 r/min離心10分鐘,分離血清,-80℃保存待測(cè)。對(duì)照組血清來自吉林大學(xué)第一醫(yī)院體檢中心體檢的健康女性血清,-80℃保存待用。

1.4 ELISA法檢測(cè)血清FS 采用FS雙位點(diǎn)ELISA[7],簡(jiǎn)言之,利用0.05 mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋鼠抗Follistatin單抗至2.5 μ g/ml,包被96孔酶標(biāo)板,每孔100 μ l,4℃過夜。次日,以洗液洗板一次,1%BSA于37℃封閉1小時(shí),棄封閉液,洗板三次,每孔加100 μ l樣本稀釋液稀釋的標(biāo)準(zhǔn)FS蛋白(0.25-16 ng/ml)或樣本。37℃孵育1小時(shí),洗板三次,每孔加100 μ l的兔抗FS 多抗(1∶500),37℃孵育1小時(shí),洗板三次,每孔加 100 μ l酶標(biāo)羊抗兔IgG抗體(1∶1 000)。37℃孵育1小時(shí),洗板三次,每孔加100 μ l鄰苯二胺(OPD)底物緩沖液,室溫避光顯色5分鐘,每孔加50 μ l 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。酶聯(lián)免疫測(cè)定儀測(cè)490 nm光吸收值(A490 nm),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中FS含量。

1.5 免疫組織化學(xué)染色觀察FS在卵巢癌組織中的表達(dá) 采用石蠟組織切片,經(jīng)常規(guī)脫臘、抗原修復(fù)后浸入到0.01 mol/L pH7.4 PBS中漂洗3×5分鐘,加入3%H2O2-甲醇液處理30分鐘,封閉細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶。浸入到0.01 mol/L pH7.4 PBS中洗3×5分鐘。0.25%TritonX-100-5%DMSO(二甲亞楓)溶液中孵育10分鐘滲透細(xì)胞膜,再浸入到0.01 mol/L pH7.4 PBS中洗3×5分鐘。滴加2%牛血清白蛋白(BSA),室溫濕盒中封閉30分鐘,以防止非特異性吸附。滴加鼠抗FS單克隆抗體[6],濕盒內(nèi)4℃孵育過夜,浸入到0.01 mol/L pH7.4 PBS中洗3×5分鐘。采用SP檢測(cè)試劑(福建邁新公司產(chǎn)品),按說明書操作,DAB顯色,蘇木精染料復(fù)染,常規(guī)梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,樹膠封片,光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤患者外周血FS水平變化 采用雙位點(diǎn)ELISA法檢測(cè)健康成年女性(30例)及不同腫瘤患者(各20例)外周血中FS水平。結(jié)果如圖1所示,卵巢癌患者外周血FS水平與健康對(duì)照組比較差異顯著,P＜0.01,肺癌、乳腺癌外周血FS水平與健康對(duì)照組比較也有差異,P＜0.05。腎癌和胃癌患者外周血FS水平與健康對(duì)照組比較無顯著差異,P＞0.05。

圖1 ELISA法檢測(cè)不同腫瘤患者及健康對(duì)照者外周血FS結(jié)果

2.2 腫瘤患者外周血FS檢測(cè)陽(yáng)性率 以大于健康女性對(duì)照組ˉx+2.5 s為陽(yáng)性,分析各組腫瘤患者FS升高陽(yáng)性率,結(jié)果如圖2所示,陽(yáng)性率依次為卵巢癌(60%)＞乳腺癌(40%)＞肺癌(30%)＞胃癌(20%)＞腎癌(0%)。

2.3 FS在不同類型卵巢癌組織的表達(dá)情況 采用抗FS單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖3顯示,不同病理類型的卵巢癌抗FS抗體染色強(qiáng)度不同,依次為粘液性癌＞子宮內(nèi)膜樣癌＞透明細(xì)胞癌＞鱗癌＞漿液性癌。該結(jié)果進(jìn)一步認(rèn)證了卵巢癌患者血清FS水平并不是全部升高的原因。

圖2 檢測(cè)不同腫瘤患者外周血FS陽(yáng)性率

圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)卵巢癌組織FS表達(dá)結(jié)果

3 討論

卵巢癌是女性生殖器官常見腫瘤之一,因其早期無癥狀,多數(shù)發(fā)現(xiàn)時(shí)即是晚期,死亡率高,因此卵巢癌診斷一直是臨床上的難題。FS與激活素的相互作用共同調(diào)控卵巢排卵和卵巢損傷上皮的修復(fù)與細(xì)胞增殖,FS與激活素共同存在、共同表達(dá)構(gòu)成一個(gè)維持卵巢正常生長(zhǎng)的平衡系統(tǒng),其中一項(xiàng)的過度表達(dá)或另一項(xiàng)的減少引起的激活素-FS系統(tǒng)的失衡,將伴隨卵巢生理過程的失調(diào)和病理過程的形成。而激活素具有很強(qiáng)的刺激細(xì)胞增殖的作用,其長(zhǎng)期過量的表達(dá)可能是誘導(dǎo)或促進(jìn)癌腫發(fā)生的因素之一,實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)作為激活素特異結(jié)合蛋白的FS雖然不能消除這種小鼠腫瘤的發(fā)生,但可顯著延長(zhǎng)生存期[8]。本研究顯示卵巢癌患者外周血FS水平升高,很有可能是作為激活素結(jié)合蛋白、其過量表達(dá)是機(jī)體為了抑制卵巢癌生長(zhǎng)的主動(dòng)的生理性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究還提示,FS的升高在檢測(cè)的數(shù)種腫瘤中,以卵巢癌的升高最明顯,陽(yáng)性率也最高,因此,外周血FS水平檢測(cè)有可能成為一種有效的臨床輔助診斷卵巢癌的腫瘤指標(biāo)。

為了闡述卵巢癌患者外周血FS水平升高以及并不是全部卵巢癌患者外周血FS檢測(cè)結(jié)果均陽(yáng)性的原因,實(shí)驗(yàn)采用抗FS單克隆抗體對(duì)不同病理類型的卵巢癌進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同病理類型卵巢腫瘤表達(dá)FS的水平不同,依次為粘液性癌＞子宮內(nèi)膜樣癌＞透明細(xì)胞癌＞鱗癌＞漿液性癌。該結(jié)果表明,卵巢癌患者外周血FS水平升高可能來源于卵巢癌組織產(chǎn)生的FS,但并不是所有卵巢癌組織均能高表達(dá)FS,這也進(jìn)一步解釋了卵巢癌患者外周血FS水平測(cè)定結(jié)果并不是全部升高的原因。

綜上所述,本研究證實(shí),具有廣泛組織分布,參與多種生物學(xué)作用的FS在卵巢癌患者外周血中高表達(dá),其升高水平與卵巢癌組織類型有關(guān),外周血FS水平測(cè)定對(duì)卵巢癌的臨床診斷具有一定的輔助診斷意義。

[1]Robertson D M,Klein R,de Vos FL,et al.The isolation of polypeptides with FSH suppressing activity from bovine follicular fluid which are structurally different to inhibin[J].Biochem Biophys Res Commun,1987,149(2):744.

[2]Ueno N,Ling N,Ying S Y,et al.Isolation and partial characterization of follistatin:a single-chain Mr 35,000 monomeric protein that inhibits the release of follicle-stimulating hormone[J].Proc Natl Acad Sci USA,1987,84(23):8282.

[3]Maguer-Satta V,Bartholin L,Jeanpierre S,et al.Regulation of human erythropoiesis by activin A,BMP2,and BMP4,members of the TGFbeta family[J].Exp Cell Res,2003,282(2):110.

[4]Nakamura T,Hasegawa Y,SuginoK,et al.Follistatin inhibits actvin-induced diffrenciation of rat follistatin grannulosa cells in vitro[J].Biochem Biophys Acta,1992,1135:103.

[5]Wakatsuki M,Shintani M,Abe M,et al.Immunoradiometric assay for follistatin:Serum Immunoreactive follistatin level in normal adult and pregnant women[J].J Clin Endocrinol Metab,1996,81:630.

[6]Liu Z H,Shintani Y,Sakamoto Y,et al.Effects of LHRH,FSH and activin A on follistatin secretion from cultured rat anterior pituitary cells[J].Endocrine J,1996,43:321.

[7]董 輝,汪 麗,韓宏偉,等.兩種卵泡抑素免疫檢測(cè)方法的比較[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2002,25(6):342.

[8]Farrell W E,Clark AJL,Stewart M F,et al.Bromocriptine inhibits Proopiomelanocortin mRNA and ACTH precursor secretion in small cell lung cancer cell lines[J].J Clin Invest,1992,90:705.

Study of the application of serum follistatin detection on the diagnosis of ovarian cancer

CHEN Fang-fang,Wang Yi-nan,Wang Li,et al.(Department of Immunology,Norman Bethune College of Medical Sciences,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the change of levels of serum follistatin(FS)in ovarian cancer patients and its clinical significance.MethodsSerum FS levels in patientswith cancer and healthy controlswere examined by ELISA;FS expression in tissues of ovarian cancer was assayed by immunohistochemical staining.ResultsThe serum FS levels in patients with ovarian cancer were significantly higher than that in healthy control group,which has statistical significance(P＜0.01).Serum FS levels in breast and lung cancer patientswere also higher than healthy control group(P＜0.05),but serum FS levels in stomach cancer and kidney cancer patients showed no difference with healthy controlgroup(P＜0.05).The positive rate of cancer diagnosis was showed as follows:ovarian cancer(60%)＞breast cancer(40%)＞lung cancer(30%)＞gastric cancer(20%)＞renal cell carcinoma(0%).Immunohistochemical staining results showed that expression levels of FS in ovarian cancer were related to tumor types,and the staining intensity was as follows:mucinous carcinoma＞endometrioid carcinoma＞squamous carcinoma＞clear cell carcinoma＞serous cystadenocarcinoma.ConclusionSerum levels of FS are increased in ovarian cancer patients and the positive rate of diagnosis are related to the type of ovarian cancer.Therefore,detection of serum FS levelsmaybe hasgreat potential in the diagnosis of ovarian cancer.

book=208,ebook=110

follistatin;enzyme-linked immunosorbent assay;ovarian cancer;diagnosis

1007-4287(2010)02-0207-03

吉林省杰出青年基金項(xiàng)目(4-20-5)

*通訊作者

R737.31

A

2009-05-16)