任 明,任淑萍,楊淑娟,凌 翎,孫景春

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室,吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗(yàn)科,吉林長(zhǎng)春 130021)

銀杏葉提取物對(duì)糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

任 明1,任淑萍1,楊淑娟1,凌 翎1,孫景春2*

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室,吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗(yàn)科,吉林長(zhǎng)春 130021)

目的觀察銀杏葉提取物對(duì)糖尿病(D M)大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響。方法利用Wistar大鼠建立糖尿病模型,將糖尿病大鼠分為糖尿病組(DM)和銀杏葉治療組(GBE),另設(shè)正常組動(dòng)物為對(duì)照。D M組和正常對(duì)照組大鼠每日通過(guò)腹腔注射給予生理鹽水0.83 ml?kg-1,GBE組大鼠每日通過(guò)腹腔注射給予GBE 0.83 ml?kg-1,連續(xù)注射30天后取血測(cè)定各組大鼠血清中丙二醛(MDA)含量和超氧陰離子(O2-)水平,然后取出胰腺、腎臟測(cè)定MDA含量并采用免疫組化S-P法(鏈霉素抗生物素蛋白一過(guò)氧化物酶)檢測(cè)腎臟蛋白激酶C(PKC)的表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組相比,DM組和GBE組大鼠血清、腎臟和胰腺中MDA的含量及血清中超氧陰離子(O2-)的水平顯著升高(P＜0.05);GBE組大鼠血清、腎臟和胰腺中MDA的含量及超氧陰離子(O2-)的水平顯著低于DM組(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明,D M組PKC表達(dá)顯著強(qiáng)于GBE組。結(jié)論銀杏葉提取物可減輕糖尿病大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平,具有抗氧化作用,對(duì)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展具有一定的預(yù)防作用。

銀杏葉提取物;糖尿病;氧化應(yīng)激

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0199)

糖尿病是多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂,是由于體內(nèi)胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足或靶組織對(duì)胰島素不敏感而引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂的疾病[1,2]。大量的研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在糖尿病和糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到非常重要的作用。銀杏葉提取物(GBE)是一種中藥提取物,研究證實(shí)GBE具有抗氧化清除自由基活性[3],本文給予糖尿病大鼠GBE,觀察銀杏葉提取物對(duì)糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 銀杏葉提取物注射液(德國(guó)威瑪舒培博士藥廠授權(quán),臺(tái)灣濟(jì)生化學(xué)制藥廠股份有限公司生產(chǎn),銀杏葉提取物含量為3.5 mg?ml-1);STZ購(gòu)自北京鼎國(guó)公司;MDA、超氧陰離子含量測(cè)定試劑盒(南京建成);PKC抗體(福州邁新公司);SP試劑盒(福州邁新公司)

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用WISTAR雌性大鼠(清潔級(jí)),體重(200±20)g,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào):(吉)2003-0007。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型建立 實(shí)驗(yàn)用大鼠購(gòu)回后飼養(yǎng)1周,觀察期大鼠的一般狀態(tài),一般狀態(tài)良好的用于實(shí)驗(yàn)。大鼠禁食12 h后,腹腔注射STZ,注射劑量為50 mg?kg-1,正常組大鼠腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液,注射劑量為50 mg?kg-1。注射STZ后,分別于注射第3、5、7日測(cè)定大鼠血糖,3次血糖測(cè)定值均高于16.7 mmo?L-1的大鼠為糖尿病模型大鼠。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及治療措施 糖尿病模型大鼠分為糖尿病組(DM)和銀杏葉提取物治療組(GBE),另設(shè)一組正常大鼠為正常對(duì)照組(C),每組10只。DM組和正常對(duì)照組大鼠每日通過(guò)腹腔注射給予0.83 ml?kg-1的生理鹽水,GBE組大鼠每日通過(guò)腹腔注射給予0.83 ml?kg-1的GBE。連續(xù)給藥30天。

1.2.3 檢測(cè)血清中MDA和超氧陰離子的含量 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行操作并計(jì)算結(jié)果。

計(jì)算公式:MDA含量(nmol/ml)=(測(cè)定管的吸光度-空白管的吸光度)÷(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/ml)×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。超氧陰離子活力單位(U/L)=(測(cè)定管的吸光度-對(duì)照管的吸光度)÷(對(duì)照管的吸光度-標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)濃度(0.15 mg/ml)×1 000 ml×樣品測(cè)試前的稀釋倍數(shù)。

1.2.4 檢測(cè)組織中MDA的含量 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行操作并計(jì)算結(jié)果。

計(jì)算公式:MDA含量(nmol/mgprot)=(測(cè)定管的吸光度-空白管的吸光度)÷(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/ml)÷蛋白含量(mgprot/ml)。

1.2.5 組織中蛋白激酶C(PKC)的表達(dá) PKC抗體檢測(cè)采用免疫組化S-P法,按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果評(píng)定:PKC表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒。根據(jù)光鏡下觀察陽(yáng)性染色細(xì)胞的比例(5個(gè)高倍視野下的均數(shù))分為:①陰性,染色細(xì)胞數(shù)＜10%;②陽(yáng)性,染色細(xì)胞數(shù)在10%-50%;③強(qiáng)陽(yáng)性,染色細(xì)胞數(shù)＞50%。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組間測(cè)定指標(biāo)比較用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 GBE對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

連續(xù)給藥30天后,與正常對(duì)照組相比,DM組和GBE組大鼠血清、腎臟和胰腺中MDA的含量及血清中超氧陰離子(O2-)的水平顯著升高(P＜0.05);GBE組大鼠血清、腎臟和胰腺中MDA的含量及超氧陰離子(O2-)的水平顯著低于DM組(P＜0.05),各組間具體的比較見(jiàn)表1、2。

2.2 腎臟組織中PKC表達(dá)的變化

經(jīng)過(guò)30天的治療后,GBE組PKC的表達(dá)率為32%,DM組PKC的表達(dá)率為58%。各組間PKC表達(dá)強(qiáng)度比較見(jiàn)圖1。

表1 各組大鼠血清、胰腺、腎MDA含量的比較(±s)

表1 各組大鼠血清、胰腺、腎MDA含量的比較(±s)

注:*與正常組相比較,P＜0.05;#與DM組相比較,P＜0.05

Groups n 血清(nmol?L-1)胰腺(nmol?mg-1) 腎(nmol?mg-1)Control 10 8.86±2.47 0.44±0.21 6.96±0.55 DM 10 16.85±1.64* 0.89±0.32* 9.72±0.37*GBE 10 10.23±2.42*# 0.70±0.27*# 8.53±0.45*#

表2 各組大鼠血清O2-活性的比較(±s)

表2 各組大鼠血清O2-活性的比較(±s)

注:*與正常組相比較,P＜0.05;#與DM組相比較,P＜0.05

Groups n O2-(U/ml)Control 10 64.59±15.43 DM 10 110.36±20.19*GBE 10 88.67±18.66*#

圖1 各組大鼠腎組織中的表達(dá)PKC

3 討論

糖尿病是當(dāng)前威脅人類健康的嚴(yán)重慢性疾病之一。長(zhǎng)期的高血糖引起全身多系統(tǒng)的代謝障礙,導(dǎo)致大血管和微血管的病變,出現(xiàn)嚴(yán)重的心、腦、腎、眼、神經(jīng)等的并發(fā)癥,嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量,甚至危及生命[4]。在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,氧化應(yīng)激發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果表明,糖尿病大鼠體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激,糖尿病大鼠體內(nèi)的MDA、超氧陰離子水平顯著升高,PKC表達(dá)增強(qiáng)。PKC是導(dǎo)致體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激的重要因素。PKC激活后可改變血管通透性,刺激血管增生,促進(jìn)粘附因子表達(dá)以及導(dǎo)致ROS的過(guò)多生成[5]。銀杏葉提取物通過(guò)其抗氧化活性,降低了糖尿病大鼠體內(nèi)的MDA和超氧陰離子水平,減弱了PKC的表達(dá),緩解了糖尿病大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀況,預(yù)防了糖尿病的進(jìn)一步惡化,對(duì)預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生起到一定的作用。本研究的結(jié)果提示,銀杏葉提取物可以作為糖尿病治療的輔助治療手段。

[1]AC Maritim,RA Sanders,JB Watkins.Diabetes,Oxidative Stress,and Antioxidants:A Review[J].J Biochem Molecular Tocicology,2003,17(1):24.

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[5]M Meier,J Menne,H Haller.Targeting the protein kinase C family in the diabetic kidney:lessons from analysis of mutant mice[J].Diabetologia,2009,52(5):765.

Effects of Ginkgo Biloba Extract on the Oxidative Stress in Diabetic Rats

REN Ming,REN Shu-ping,YANGShu-juan,et al.(Department of Hygienic Toxicology,School of Public Health,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo explore the effects of Ginkgo Biloba extract on the oxidative stress in diabetic rats.MethodsWistar rats were used to establish diabetic model rats,and the diabetic model rats were randomly classified into diabetic group in which the rats were administered saline intraperitoneally at the dose of 0.83 ml?kg-1,and GBE group in which rats were administered GBE intraperitoneally at the dose of 0.83 ml?kg-1.Normal ratswere used as normal control.After 30 days,the serum in rats from different groupswere collected to test the level of superoxide anion and malondialdehyde,the expression of protein kinase C(PKC)in kidney was alsto determined.ResultsThe level of MDA and superoxide anion in rats from diabetic group was significantly higher than those from normal control and GBEgroup.The expression ofPKC indiabetic ratswas stronger thanthat inGBE rats.ConclusionGBE can attenuate the oxidative stress in diabetic rats and play a role in the prevention of diabetic complicaiton development.

Ginkgo Biloba extract;diabetes mellitus;oxidative stress

R587.1

A

1007-4287(2010)02-0199-03

吉林省中醫(yī)藥管理局課題(08sys-063);吉林省衛(wèi)生廳課題(20089010)

*通訊作者

2009-04-17)