劉泊明,張冰潔,楊 賁,郝繼龍*

(1.伊通滿族自治縣第一人民醫(yī)院眼科,吉林伊通 130700;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院眼科,吉林長春 130033)

多核白細(xì)胞彈性蛋白酶對人角膜基質(zhì)細(xì)胞MMP-2 、MMP-9 表達(dá)的影響

劉泊明1,張冰潔2,楊 賁2,郝繼龍2*

(1.伊通滿族自治縣第一人民醫(yī)院眼科,吉林伊通 130700;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院眼科,吉林長春 130033)

目的觀察多核白細(xì)胞彈性蛋白酶與白細(xì)胞介素-1α對人角膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的MMP-2、MMP-9的影響,進(jìn)而探討角膜潰瘍的發(fā)生機(jī)理。方法體外培養(yǎng)人角膜基質(zhì)細(xì)胞,在培養(yǎng)液中添加或不添加多核白細(xì)胞彈性蛋白酶或白細(xì)胞介素-1α,培養(yǎng)5天,通過明膠酶譜分析的方法測定培養(yǎng)上清中的MMP-2和MMP-9的表達(dá)。結(jié)果體外培養(yǎng)的人角膜基質(zhì)細(xì)胞無任何刺激下可釋放MMP-2;白細(xì)胞介素-1α可加強(qiáng)并激活MMP-2的表達(dá),同時可誘導(dǎo)MMP-9前體的釋放;多核白細(xì)胞彈性蛋白酶在白細(xì)胞介素-1α誘導(dǎo)下可完全激活前體MMP-9轉(zhuǎn)化為活化形式。結(jié)論多核白細(xì)胞彈性蛋白酶和白細(xì)胞介素-1α協(xié)同作用參與角膜潰瘍的發(fā)生。

多核白細(xì)胞彈性蛋白酶;白細(xì)胞介素-1α;角膜基質(zhì)細(xì)胞;MMP-2;MMP-9

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0855)

角膜潰瘍是指角膜組織缺損超越前彈力層、伴有角膜基質(zhì)溶解的病理狀態(tài),角膜基質(zhì)的溶解是由于角膜細(xì)胞外基質(zhì)蛋白以及I型膠原和蛋白多糖的過度降解造成的,白細(xì)胞浸潤參與這一過程,多核白細(xì)胞可以通過釋放過氧化氫、自由基、彈性蛋白酶、組織蛋白酶、膠原酶和明膠酶等導(dǎo)致病理性組織損傷,而其中的多核白細(xì)胞彈性蛋白酶可降解許多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如彈性蛋白,糖蛋白,膠原,纖維連接蛋白等[1]。角膜基質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生多種類型的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)[2],這些MMP均以酶原即潛酶的形式分泌到細(xì)胞外,需在細(xì)胞外經(jīng)酶活化之后才能發(fā)揮其酶的作用。本文利用明膠酶譜法觀察多核白細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophilelastase,NE)在白細(xì)胞介素-1α(Interleukin-1α,IL-1α)介導(dǎo)下對人角膜基質(zhì)細(xì)胞MMP-2和MMP-9的影響。

1 材料與方法

1.1 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

人角膜取自于意外死亡的眼球捐獻(xiàn)者,供體角膜中央部分用于穿透性角膜移植,殘余周邊部分用于本試驗。按我們以前報告的方法[3]將供體角膜殘余部分自角膜緣內(nèi)1 mm剪開,去除角膜緣及鞏膜部分,刮除角膜上皮及內(nèi)皮,角膜基質(zhì)以膠原酶消化,分離角膜基質(zhì)細(xì)胞,原代培養(yǎng)于含10%胎牛血清MEM培養(yǎng)液中,傳代培養(yǎng)4-5代的細(xì)胞用于實驗。

1.2 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的鑒定

實驗前倒置顯微鏡下觀察角膜基質(zhì)細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞的鑒定采用抗Vimentin抗體(非上皮細(xì)胞標(biāo)志)、抗Cytokeratin抗體(上皮細(xì)胞表面標(biāo)志)、抗α-SMA(肌樣成纖維細(xì)胞表面標(biāo)志)行免疫染色[4]。

1.3 明膠酶譜法測定MMP-2和MMP-9的表達(dá)

將角膜基質(zhì)細(xì)胞以0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液,稀釋至約1×104/mL后置入6孔板培養(yǎng)至80%融合,之后換成不含有血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1天,使細(xì)胞達(dá)到同步化。添加或不添加多核白細(xì)胞彈性蛋白酶(30 nm,Sigma,美國)及 IL-1α(0.3 ng/ml,Genzyme,美國)的無血清MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)5天。收集上清液,根據(jù)細(xì)胞計數(shù)調(diào)整各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的蛋白濃度,加入非還原十二烷基硫酸鈉(SDS)樣品緩沖液(125mM Tris-HCl[pH6.8],20%甘油,2%SDS,0.002%溴酚藍(lán))。配制含0.1%明膠的10%SDS聚丙烯酰胺凝膠,在4℃進(jìn)行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[5]。凝膠在2.5%的Triton X-100中振蕩洗脫1 h,放入孵育液(50 mM Tris-HCl[pH 7.5]、5 mM CaCl和1%TritonX-100)中37℃中18 h。最后用考馬斯亮藍(lán)R250染色,脫色劑脫色至藍(lán)色背景下可見清晰白色條帶。

2 結(jié)果

如圖所示,在無角膜基質(zhì)細(xì)胞的情況下,上清中無論是否添加多核白細(xì)胞彈性蛋白酶及IL-1α均不能檢測到MMP-2或MMP-9的存在。角膜基質(zhì)細(xì)胞在無任何刺激下可釋放前體MMP-2(72 kD)和活化形式的MMP-2(66 kD);添加IL-1α后可增加并激活MMP-2的表達(dá),同時誘導(dǎo)前體MMP-9(92 kD)的釋放;同時添加多核白細(xì)胞彈性蛋白酶及IL-1α?xí)r可將前體MMP-9(92 kD)完全轉(zhuǎn)化為活化形式的MMP-9(83 kD)。

圖1 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和IL-1對角膜基質(zhì)細(xì)胞膠原酶活性的影響

3 討論

角膜潰瘍是由于角膜基質(zhì)膠原和糖蛋白的過分溶解所致,角膜基質(zhì)細(xì)胞是角膜組織中重要的細(xì)胞成分,它所產(chǎn)生的MMP在細(xì)胞外經(jīng)酶活化之后發(fā)揮作用。MMPs是一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的鋅依賴性內(nèi)肽酶,MMP如果過度表達(dá),可以引起基質(zhì)膠原的過度降解、形成角膜潰瘍[2],其中最重要的是膠原酶和明膠酶,MMP-2和MMP-9屬后者,MMP-2被稱為明膠酶A,MMP-9稱為明膠酶B。MMP-2是家族中含量最豐富、分布最廣的一種,它與MMP-9因優(yōu)先降解基底膜成分如Ⅳ型膠原,是目前眼組織中研究得比較廣泛的MMP成員[6]。現(xiàn)已證實在角膜炎[7]、角膜堿燒傷[8]、角膜移植排斥反應(yīng)[9]中MMP-2、MMP-9的表達(dá)均增加并被激活。MMP-2是正常角膜細(xì)胞產(chǎn)生的主要蛋白酶,在正常角膜內(nèi)主要以酶原形式存在,起著“監(jiān)視”功能,當(dāng)機(jī)體受到炎癥反應(yīng)等刺激時,MMP-2被激活釋放催化膠原降解[10]。我們以前的實驗已證實存在纖維溶酶原的情況下,IL-1α促進(jìn)角膜基質(zhì)細(xì)胞的膠原降解[11]。Geraghty等報道多核白細(xì)胞彈性蛋白酶可增加人巨噬細(xì)胞表達(dá)前體和活化形式的MMP-2[12]。Itoh等也報道了多核白細(xì)胞彈性蛋白酶能降解與MMP-9結(jié)合的TIMP-1,但不破壞MMP-9,可作用于MMP-9使之被活化為分子量82 kD的片斷[13]。這些都與本文得到的結(jié)果一致,角膜基質(zhì)細(xì)胞可釋放MMP-2(前體和活體形式);添加IL-1α后可激活MMP-2,同時誘導(dǎo)前體MMP-9釋放;多核白細(xì)胞彈性蛋白酶在IL-1α的誘導(dǎo)下可完全激活前體MMP-9轉(zhuǎn)化為活化形式,這些均提示彈性蛋白酶和IL-1α在角膜潰瘍的發(fā)生中起著重要的作用,并且二者有協(xié)同作用。

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Effects of neutrophil elastase on expression of the MMP-2,9 in cultured human corneal fibroblasts

LIU Bo-ming1,ZHANG Bing-jie2,YANGBen2,et al.(1.Departmentof Ophthalmology,The firstpeople's hospitalofYitongManchu AutonomousCounty,Jilin Yitong130700,China;2.Department of Ophthalmology,China-Japan Union Hospital of JilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo understand the mechanism of corneal ulceration,we investigated the role of neutrophil elastase(NE),interleukin-1α(IL-1α)and corneal fibroblasts on expression of the matrix metalloproteinases(MMP)-2,9 in cultured human corneal fibroblasts.MethodsNE or IL-1αwas added to the culture medium of human corneal fibroblasts 5 day later.The activity of MMP-2 and MMP-9were examinedby Gelatin zymography.ResultsCulturedhuman cornealfibroblasts releasedMMP-2 without any stimulation.IL-1αenhanced and activated the expression of MMP-2,while induced the release of proMMP-9.NE transformed proMMP-9into active forms induced by IL-1α.ConclusionNE and IL-1α can promote human corneal fibroblasts in collagen degradation,the two are synergistic.

neutrophil elastase;interleukin-1α;human corneal fibroblasts;MMP-2;MMP-9

R772.21

A

1007-4287(2010)06-0855-03

國家自然科學(xué)基金資助項目(30772384)

*通訊作者

2009-05-20)