談忠鳴,湯奮揚,陳 萍,錢慧敏

江蘇省1例布魯氏菌病的實驗室檢測及分子分型

談忠鳴1,湯奮揚1,陳 萍2,錢慧敏1

目的利用免疫學(xué)抗體檢測及分子分型,確診1例臨床疑似布魯氏菌病病例。方法 虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗檢測血清中抗體,PCR方法及測序技術(shù)檢測布魯氏菌特異基因。結(jié)果 病人血清中抗體陽性,疑似菌株經(jīng)PCR鑒定為羊種布魯氏菌。結(jié)論 此次感染者之病原體為羊種布魯氏菌。

布魯氏菌病;羊種布魯氏菌;血清學(xué);PCR;分子分型

2009年7月江蘇某醫(yī)院收治1例疑似布病患者,為盡快查明病因?qū)ΠY治療,該院進(jìn)行了分離培養(yǎng),并將疑似致病菌株及病人血液送本中心鑒定,本中心運用PCR快速方法6h檢測出結(jié)果并將結(jié)果反饋醫(yī)院,現(xiàn)將實驗結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 血清取自病人,菌株由醫(yī)院檢驗科從病人血液中分離,送本中心后轉(zhuǎn)種血平板,置37℃溫箱中培養(yǎng)(雙份培養(yǎng)其中1份置于5%CO2環(huán)境中)。

1.2 試劑 TaKaRa LA Taq酶、dNTPs購自寶生物工程(大連)有限公司,PCR擴增引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,布魯氏菌虎紅平板凝集試劑和試管凝集試劑購自中國疾病預(yù)防控制中心流行病研究所布病室。

1.3 鑒定步驟 所有活菌操作均在P2+實驗室中進(jìn)行。

1.3.1 血清抗體檢測 取10μ L虎紅平板凝集試劑和10μ L病人血清在玻片上混勻,2min內(nèi)觀察結(jié)果。試管凝集試驗步驟按照試劑說明書操作。

1.3.2 PCR檢測 從平板上挑取疑似菌落,煮沸法制備DNA模板。普通PCR檢測布氏桿菌BCSP31基因(中國疾病預(yù)防控制中心布病室提供),此基因是一種免疫原性膜蛋白基因,具有高度的特異性和同源性。擴增片段為223bp,25μ L 反應(yīng)體系:10×buffer 2.5μ L,dNTP 1.5μ L,引物各1μ L,Taq酶 0.5μ L,DNA 模板1μ L,雙蒸水補足。循環(huán)條件:93℃預(yù)變性 5min,90℃ 1min、60℃ 1min、72℃ 1min(30個循環(huán)),72℃延伸10min,4℃保存。分型采用三重PCR檢測布魯桿菌IS711基因〔1-2〕,根據(jù)該基因插入序列在不同種布氏菌基因組中插入位置的差異,可在分子水平上鑒定牛種、羊種和豬種布氏菌。合成3條上游引物BMAS-M-F、BMAS-A-F、BM AS-S-F和一條下游引物 BMAS-R〔3〕。擴增片段大小為:羊種 310bp、牛種 488bp、豬種 737bp。PCR 50μ L 反應(yīng)體系:10×buffer 5μ L,dNTP 8μ L,引物各 1μ L,Taq酶0.5μ L,DNA模板 1μ L,雙蒸水補足。循環(huán)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃ 30sec、55℃40sec、72℃30sec(30 個循環(huán)),72℃延伸7min,4℃保存。分別取兩種 PCR產(chǎn)物各7.5μ L,1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析,回收產(chǎn)物,送生物公司測序。

2 結(jié) 果

2.1 菌落形態(tài) 24h后平板上長出微小、無色、透明的光滑型菌落,無溶血現(xiàn)象。

2.2 血清抗體結(jié)果 虎紅平板凝集試驗出現(xiàn)白色抗原抗體結(jié)合物。試管凝集試驗結(jié)果為1∶100(+++)。

2.3 PCR結(jié)果 PCR檢測布氏菌的BCSP31基因為陽性;三重PCR檢測IS711序列,在310bp左右出現(xiàn)陽性條帶,表明此次感染人的致病微生物為羊種布氏菌。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后在GenBank中比對,確認(rèn)為布氏菌BCSP31基因和羊種布氏菌IS711基因序列。電泳結(jié)果見圖1、2。

3 討 論

布氏菌病(brucellosis)是由布氏菌引起的人畜共患的乙類傳染病,臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,波狀熱型曾被認(rèn)為是最典型的熱型,近幾年來,波狀熱已屬罕見,而多見的是長期慢性不規(guī)則的低熱,慢性期患者更是如此〔3〕。其他癥狀有多汗、關(guān)節(jié)痛、睪丸痛、肝脾腫大為特點,病情輕重差異很大,易誤診。臨床醫(yī)生較多考慮為結(jié)核、傷寒、血液病或結(jié)締組織病。

本病例于2009年4月份出現(xiàn)38.5℃發(fā)熱、咳嗽等癥狀,經(jīng)醫(yī)院門診輸液治療后好轉(zhuǎn)。5月份患者再次出現(xiàn)39.8℃發(fā)熱,咳嗽等癥狀,經(jīng)同一醫(yī)院輸液治療好轉(zhuǎn)。2009年6月份患者38.6℃發(fā)熱,發(fā)熱前有畏寒,發(fā)熱以午后為重,伴干咳,有夜間盜汗、消瘦等癥狀,CT顯示脾臟輕度腫大。

患者為當(dāng)?shù)厥桌±?經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查,患者居住城市小區(qū),衛(wèi)生條件良好,附近無大型牛、豬、羊等家畜養(yǎng)殖所。2009年3月患者曾與被遺棄的病貓有過接觸,喂過1次,后病貓死亡,被該患者丟棄至垃圾桶。懷疑病貓是此次病例的可能傳染源,國外也有過病貓傳人且從病貓的組織中分離布魯氏菌的報道〔4〕和實驗室條件下致貓感染的報道〔5〕。但本次病例由于患者發(fā)病時間較長,無法取得病貓樣進(jìn)行驗證。本次病例不能排除輸入的可能性。

本次實驗室檢測用的虎紅平板凝集試驗(RBPT)和試管凝集試驗(SAT),為我國布病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),因其方法簡便快速,對實驗室要求不高可應(yīng)用于初篩及早期診斷,但單獨使用敏感性和特異性一般,且不能區(qū)分人工免疫與自然感染,一般結(jié)合臨床癥狀做輔助診斷。

本次實驗擴增的布氏菌表面蛋白31基因(BSCP31)是具有免疫原性的可溶性細(xì)胞表面蛋白質(zhì),能夠穩(wěn)定地存在于毒力不同的布氏菌的基因組中,但其基因功能尚不清楚。目前對人致病的布氏菌主要是羊、牛、豬3種?，F(xiàn)有的實驗室分型方法如硫化氫產(chǎn)生量測定、染料抑菌試驗、單相特異性血清A、M 凝集試驗、布氏菌噬菌體裂解試驗等,對實驗操作人員的經(jīng)驗要求較高,實驗周期長,敏感性和特異性一般。根據(jù)插入序列IS711分別在牛、羊、豬3個種型的基因組中插入位置的差異設(shè)計的多重PCR,可同時鑒別感染人的3種布氏菌,并在敏感性和特異性上均高于傳統(tǒng)方法。本次實驗運用兩種PCR方法,分離出致病菌株后從提取核酸到檢測出陽性結(jié)果共耗時6h。為確保實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠,后將PCR產(chǎn)物送生物公司測序驗證結(jié)果?？梢娺\用PCR技術(shù)對布氏菌進(jìn)行鑒定,特別是在分子水平上對布魯菌進(jìn)行分型的方法,能夠為臨床的診斷治療、疫情的處理控制提供快速準(zhǔn)確的依據(jù)。

〔1〕 Baddour MM,Alkhalifa DH.Evaluation of three polymerase chain reaction techniques for detection ofBrucellaDNA in peripheral human blood〔 J〕.Can J Microbiol,2008,54(5):352-357.

〔2〕杜昕穎,汪舟佳,王玉飛,等.三重 PCR鑒別牛、羊和豬3個布氏桿菌種的方法研究〔J〕.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2009,34(1):110-112.

〔3〕衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局.布魯菌病防治手冊〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:100-103.

〔4〕Repina LP,Nikulina AI,Kosilov IA.A case of human infection with brucellosis from a cat〔J〕.Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol,1993,(4):66-68.

〔5〕T olari F,Farina R,Arispici M,et al.Brucellosis in the cat.Experimental infection with Brucella canis〔J〕.Ann Sclavo,1982,24(6):577-585.

Laboratory examination and molecular typing for one case of brucellosis in Jiangsu Province

TAN Zhong-ming,TANG Fen-yang,CHEN Ping,QIAN Hui-min
(J iangsu Provincial Center for Disease Prevention and Control,NanJ ing210009,China)

To use antibody detection and molecular typing to diagnose a brucellosis suspected patient clinically,antibody was detected by rose bengal plate agglutination test and serum agglutination test,and specific gene ofBrucellawere detected by PCR and DNA sequencing.Detection result showed that serum antibody in the patient was positives and the isolate was identified asBrucellamelitensisby PCR.It＇s indicated that the pathogenic microorganism that infected human isBrucella melitensis.

brucellosis;Brucella melitensis;serology;PCR;molecular-typing

R378.5

B

1002-2694(2010)08-0787-02

湯奮揚,Email:tfyepi@jscdc.cn

1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心,南京 210009;2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院

2010-01-15;

2010-04-30