陳小燕，蔡振寨，滿曉華，王偉忠，李兆申

(1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325027；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433；3.第二軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)教研室，上海 200433)

迷走神經(jīng)背核(dorsal motor nucleus，DMN)是重要的內(nèi)臟運動核團，參與胰腺外分泌功能的調(diào)節(jié)。研究表明，生長抑素（somatostatin，SS）不是直接通過迷走傳入神經(jīng)纖維和迷走傳出神經(jīng)纖維發(fā)揮抑制其胰腺外分泌功能的效應(yīng)，而是在中樞發(fā)揮對胰腺外分泌功能的抑制作用[1]。側(cè)腦室內(nèi)微量注射SS對甲狀腺素激素（thyrotropin-releasing hormone，TRH）刺激的胰腺外分泌有抑制作用，但是對基礎(chǔ)胰液分泌沒有抑制作用[2]。我們先前的研究證實，DMN微量注射外源性SS對大鼠胰腺基礎(chǔ)外分泌具有抑制作用[3]。在本研究中，我們采用人工合成生長抑素八肽——善寧（Sandosta-tin），來觀察DMN微量注射生長抑素對大鼠胰腺內(nèi)神經(jīng)元活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、儀器和試劑 健康雄性SD大鼠12只(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)，清潔級，體重250～300g；立體定向儀、微操縱儀、微量注射儀(日本Narishige公司)；善寧（瑞士諾華制藥有限公司）；2%旁安天藍（PSB），第二軍醫(yī)大學(xué)生理教研室王偉忠老師饋贈；直徑0.7 mm的一次性使用intima-II靜脈留置針（江蘇碧迪醫(yī)療器械有限公司）；兔抗c-fos多克隆抗體（Oncogen公司）；EnvisionTM兩步法免疫組化試劑盒（DAKO公司）；BH-2、BX-50顯微鏡（Olympus公司）；恒流泵HL-2B（上海市清浦滬西儀器廠）；T7014 X 700線CCD彩色攝像機（美國）。

1.2 動物分組及實驗步驟 健康雄性SD大鼠12只隨機分為兩組，對照組6只，實驗組6只。其中實驗組DMN微量注射SS，對照組DMN微量注射人工腦脊液（artificial cerebrospi-nal fluid，aCSF），aCSF的配制采用Yamatomo配方[4]。實驗前大鼠禁食過夜，自由飲水。以2%氯胺酮腹腔麻醉（60～80 mg/kg），建立外分泌功能研究大鼠模型[5]。通過紅外線烤燈使大鼠肛溫維持在37 ℃左右，實驗過程中每半小時追加一次1/3麻醉劑量的氯氨酮。將大鼠固定于立體定向儀上，用安爾碘消毒后顱部皮膚，切開顱頂至背部正中皮膚，去除部分枕骨和小腦，充分暴露延髓背面。瓊脂生理鹽水棉球?qū)?chuàng)面周圍圍成一池狀，池中倒入溫石蠟油。另用安爾碘消毒腹部皮膚后，沿腹正中切口開腹，暴露胃及十二指腸、胰腺，在幽門下5 mm和十二指腸、空腸交界處分別置直徑2 mm的塑料管并固定待十二指腸灌注。動物穩(wěn)定30 min后，將2根外徑1.0 mm的細玻璃管拉制成尖端外徑20～30μm的兩管微量注射管，并分別灌入0.4μg/mL的善寧和aCSF，善寧溶于aCSF。兩管微量注射管安裝在注射用的微操縱儀上，通過微量注射儀注射藥物，注射體積為100 nL，注射時間為30 s，注射后微量注射管停留在藥物注射部位5 min。DMN的立體定位以延髓閂部（obex）為參考點，向前0.6～0.8 mm，旁開0.5～0.6 mm，深度0.5～0.6 mm。微量注射畢以恒流泵HL-2B按3 mL/h的速度向十二指腸內(nèi)灌注20%脂肪乳液1 h。實驗結(jié)束后將染料2% PSB 50 nL微量注射至藥物注射部位。過量氯氨酮深度麻醉大鼠，經(jīng)左心室-升主動脈插管，先灌注溫生理鹽水100～200 mL，先快后慢。再灌注0.1 mmol/L PBS配制的4%多聚甲醛（4 ℃）350～400 mL，先快后慢，約60～80 min。取胰腺標(biāo)本冰凍切片。并去除顱骨，小心取出完整腦干并放入4 ℃ 4%多聚甲醛中后固定4 h，再移入含30%蔗糖的0.1 mmol/L PBS溶液中，4 ℃過夜儲存沉底。再進行冰凍切片，將延髓作50μm的冠狀切片，1%中性紅染色，在顯微鏡下尋找染點，根據(jù)Paxinos and Watson圖譜[6]，觀察其在延髓中的分布。

1.3 胰腺內(nèi)神經(jīng)元免疫組化染色 胰腺標(biāo)本行冰凍切片（16μm），置入預(yù)冷4 ℃的丙酮固定30 min，室溫自然干燥、復(fù)溫，0.01 mol/L PBS洗3×10 min，置入含1.5% H2O2、20%甲醇、0.2% triton的PBS液室溫孵育20 min，0.01 mol/L PBS洗3×10 min，置入含0.01 mol/L BSA、0.5% triton的PBS液室溫孵育2 h，加c-fos一抗（1∶10000）4 ℃孵育48 h，0.01 mol/L PBS洗3×10 min，加兔二抗（Envision試劑盒）37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗3×10 min，DAB顯色2～3 min，蘇木素襯染3～5 min，酸酒精分化30 s，流水沖洗、藍化，自然風(fēng)干，中性樹脂封片，56 ℃烤箱過夜。陰性對照：PBS代替一抗、二抗。陽性對照：大鼠腦組織冰凍切片。

1.4 計算機圖像分析 彩色病理圖像分析軟件采用IMS型計算機彩色圖像分析綜合系統(tǒng)，是華東理科大學(xué)自動化研究所和上海醫(yī)科大學(xué)共同研制開發(fā)的產(chǎn)品。在Olympus光學(xué)顯微鏡下用IMS型計算機彩色圖像分析綜合系統(tǒng)在每張切片同一結(jié)構(gòu)位置隨機挑選5個視野（×200），測量以下參數(shù)，每張切片測量3次取其均值：①陽性強度均值表示窗內(nèi)免疫反應(yīng)陽性強度均值，可以客觀反映免疫陽性反應(yīng)的強度。②陽性面積表示窗內(nèi)陽性免疫反應(yīng)面積，可以客觀反映免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物分布的數(shù)量。③陽性比率（%）＝陽性反應(yīng)面積/陰陽面積和×100%，可以客觀反映陽性產(chǎn)物和陰性產(chǎn)物的相對比率。④陽性面積比（%）＝陽性反應(yīng)面積/測量面積×100%，可以客觀反映免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物面積占總測量面積的百分比。⑤陽性指數(shù)（positive index，PI）=陽性反應(yīng)面積×陽性強度值/測量面積，是客觀反映免疫反應(yīng)陽性強度的總指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用t檢驗。

2 結(jié)果

兩組大鼠胰腺及胰島組織內(nèi)均有c-fos陽性神經(jīng)纖維分布（見圖1、圖2），但實驗組和對照組比較，胰腺內(nèi)c-fos免疫陽性神經(jīng)纖維陽性強度均值、陽性面積、陽性比率、陽性面積比和陽性指數(shù)均明顯降低，各參數(shù)的均值與對照組相比，差異有顯著性（P<0.05）（見表1）。

圖1 實驗組大鼠胰腺標(biāo)本c-fos免疫組化染色結(jié)果（×200）

圖2 對照組大鼠胰腺標(biāo)本c-fos免疫組化染色結(jié)果（×200）

表1 c-fos胰腺內(nèi)免疫陽性神經(jīng)纖維圖像分析結(jié)果（±s，n=6）

表1 c-fos胰腺內(nèi)免疫陽性神經(jīng)纖維圖像分析結(jié)果（±s，n=6）

與對照組比：*P<0.05，**P<0.01

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3 討論

胰腺外分泌功能是餐后食物消化吸收過程的重要組成部分，受神經(jīng)和體液因素（主要為促胰液素與膽囊收縮素）的雙重支配。在胰腺外分泌功能的體液調(diào)節(jié)因素中SS是最強的抑制胰液分泌的激素，其效應(yīng)為劑量正相關(guān)性，它的作用機制目前尚不清楚。Li等[1]在SD大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，SS是在中樞發(fā)揮對胰腺外分泌功能的抑制作用。Masuda等[7]發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射SS明顯抑制胰腺的外分泌，該效應(yīng)不能被迷走神經(jīng)切斷術(shù)、心得安（β受體阻滯劑）所阻斷，但可以被α受體阻滯劑六烴季銨（hexamethonium）和酚妥拉明（phentolamine）所阻斷。靜脈給予SS模擬側(cè)腦室注射后血液中的SS濃度對胰腺外分泌功能的抑制效應(yīng)遠不如前者，兩者差異具有顯著性。這個實驗亦說明SS在中樞發(fā)揮對胰腺外分泌的抑制效應(yīng)。中樞對胰腺分泌功能的調(diào)節(jié)主要是通過DMN發(fā)出的副交感運動神經(jīng)起作用。免疫組化方法發(fā)現(xiàn)，在迷走神經(jīng)復(fù)合體（dorsal vagal complex，DVC）中廣泛分布SS陽性的神經(jīng)元[8]。以往零星的研究發(fā)現(xiàn)，DMN微量注射TRH能刺激胰腺分泌[9]，而胰多肽（pancreatic polypeptide，PP）則能抑制胰腺分泌[10]。腦內(nèi)注射SS、鈣調(diào)基因相關(guān)肽（calcitonin gene-regulated peptide，CGRP）亦對胰腺分泌有抑制作用[1，11]。但各種中樞神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)胰腺分泌的作用通路，它們對迷走傳出神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)、對胰腺內(nèi)神經(jīng)元的調(diào)控，以及特定神經(jīng)遞質(zhì)對胰腺分泌的特異性調(diào)節(jié)作用尚未見報道。DMN的迷走傳出神經(jīng)對胰腺分泌的調(diào)控是非常復(fù)雜的，其一方面接受孤束核（nucleus of the solitary tract，NTS）的傳入信息，另一方面也接受高級中樞的控制[12]，此外，血循環(huán)中一些內(nèi)分泌因素可通過血腦屏障薄弱處直接作用于DMN[13]。我們認(rèn)為，DMN迷走傳出神經(jīng)對胰腺功能的調(diào)節(jié)是眾多興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)綜合作用而間接發(fā)揮作用的，迷走神經(jīng)傳出纖維作用于胰腺內(nèi)神經(jīng)，后者綜合各種中樞信息，調(diào)節(jié)胰腺功能。研究發(fā)現(xiàn)DMN迷走傳出神經(jīng)有多種神經(jīng)遞質(zhì)，如乙酰膽堿、NOS及各種神經(jīng)肽（VIP、NPY、GRP）等[14]，因此，我們推測特定的刺激可以作用于某一組迷走運動神經(jīng)元，它們有特定的神經(jīng)遞質(zhì)，這些傳出纖維作用于具有不同的特有神經(jīng)遞質(zhì)的胰腺內(nèi)神經(jīng)元，從而調(diào)控不同的胰腺功能。

我們先前的研究[3]表明，DMN微量注射外源性SS對單位時間內(nèi)胰液基礎(chǔ)分泌的體積和胰液蛋白質(zhì)分泌量均有顯著的抑制效應(yīng)，其差異有顯著性，證實DMN在胰腺外分泌功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，外源性SS在DMN發(fā)揮對胰腺外分泌功能的抑制作用。還有研究發(fā)現(xiàn)[15]，DVC微量注射SS是通過生長抑素受體-2發(fā)揮其抑制胰腺外分泌的作用的。但其對胰腺內(nèi)神經(jīng)元活性影響的研究未見報道。為了探討迷走神經(jīng)背核SS對胰腺外分泌功能的調(diào)控及其機制，本研究采用臨床常用的人工合成生長抑素八肽——善寧作為中樞微量注射的藥物觀察DMN微量注射SS對胰腺內(nèi)神經(jīng)元活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺內(nèi)c-fos免疫陽性神經(jīng)纖維陽性強度均值、陽性面積、陽性比率、陽性面積比和陽性指數(shù)均明顯減少。其結(jié)果一方面進一步證實DMN在胰腺外分泌功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，另一方面也說明外源性SS在DMN發(fā)揮對胰腺內(nèi)神經(jīng)元的抑制作用，從而對胰腺外分泌功能發(fā)揮抑制作用。迷走神經(jīng)節(jié)前纖維起源于迷走神經(jīng)背核，到達胰腺內(nèi)的神經(jīng)節(jié)換元，節(jié)后纖維支配胰腺腺泡細胞和胰腺導(dǎo)管細胞，大部分節(jié)后纖維末梢釋放Ach，通過M受體加強胰腺外分泌功能。一部分節(jié)后纖維是非膽堿能非腎上腺素能的，有的釋放興奮性遞質(zhì)，有的釋放抑制性遞質(zhì)。迷走神經(jīng)背核SS的抑制胰腺外分泌功能的效應(yīng)可能是通過抑制胰腺內(nèi)迷走興奮性纖維所致。由此我們認(rèn)為，DMN微量注射SS引起的抑制胰腺外分泌功能的效應(yīng)可能是SS抑制了迷走神經(jīng)背核中的膽堿能神經(jīng)元，使迷走神經(jīng)興奮性傳出沖動減少，胰腺內(nèi)神經(jīng)元的興奮性沖動減少，出現(xiàn)抑制效應(yīng)。本研究進一步證實迷走神經(jīng)背核注射外源性SS抑制胰腺內(nèi)神經(jīng)元的活性，從而發(fā)揮對胰腺外分泌功能的抑制作用。

進一步研究可使用神經(jīng)元活性示蹤物質(zhì)c-fos的免疫組織化學(xué)方法觀察DMN微量注射SS后胰腺內(nèi)膽堿能神經(jīng)元和各種肽能神經(jīng)元活性改變，進一步深入了解胰腺外分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機制。

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