黃 卓，李東棟，張 琳，嚴(yán) 珊

（海南大學(xué) 材料與化工學(xué)院，海南 海口 570228）

SOE-PCR技術(shù)在洛伐他汀九酮合成酶基因克隆中的應(yīng)用

黃 卓，李東棟*，張 琳，嚴(yán) 珊

（海南大學(xué) 材料與化工學(xué)院，海南 ?？?570228）

為了驗(yàn)證SOE-PCR技術(shù)在洛伐他汀九酮合成酶基因（LOVB）克隆中的應(yīng)用，以土曲霉基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)4對(duì)引物，分別擴(kuò)增LOVB的4個(gè)外顯子，并按一定的順序，利用SOE-PCR技術(shù)將其一一串聯(lián)起來(lái)，形成LOVB①-④的cDNA序列.結(jié)果表明：重疊延伸PCR成功擴(kuò)增出了LOVB①-④的cDNA序列，大小1.3kb左右，測(cè)序結(jié)果和NCBI中登錄號(hào)為AF151722. 1的洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④的cDNA序列比對(duì)，同源性為98.5％.

重疊延伸PCR；洛伐他汀；聚酮合成酶；他汀類(lèi)藥物

洛伐他?。╨ovastatin）是一種絲狀真菌的次生代謝產(chǎn)物，它能競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽固醇生物合成限速酶HMG-CoA還原酶的活性，是一種有效的降膽固醇藥物［1］.洛伐他汀是第一個(gè)經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市的降血脂他汀類(lèi)藥物，自1979年第一次從紅曲霉中分離出后，因其良好的降血脂功能，吸引了人們對(duì)其藥物機(jī)理、生物合成、發(fā)酵及臨床應(yīng)用等方面研究的興趣［2-4］.已知的洛伐他汀產(chǎn)生菌主要是土曲霉和紅曲霉.利用土曲霉生產(chǎn)洛伐他汀是目前主要的工業(yè)化生產(chǎn)方法.目前國(guó)內(nèi)一般是通過(guò)菌種改良、優(yōu)化發(fā)酵條件和優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)物分離純化方法來(lái)提高洛伐他汀產(chǎn)率，但這類(lèi)方法提高洛伐他汀生產(chǎn)水平的效果是有限的.隨著洛伐他汀生物合成酶基因結(jié)構(gòu)與功能研究的不斷深入，通過(guò)基因工程技術(shù)來(lái)提高洛伐他汀產(chǎn)率是近年來(lái)的主要方向.筆者根據(jù)Kenndy J等［5］報(bào)道的土曲霉基因組DNA中LOVB的基因序列，設(shè)計(jì)4對(duì)引物，利用SOE-PCR技術(shù)獲得LOVB①-④的cDNA序列，為今后畢赤酵母表達(dá)洛伐他汀九酮合成酶基因奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

1.1.1 菌種

E.coli JMl09（本實(shí)驗(yàn)室保存），土曲霉（購(gòu)自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心）.

1.1.2 試劑

Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶購(gòu)自Fermentas公司；pMDR18-TVector試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 Marker、λDNA/Hind III Marker購(gòu)自廣州東盛科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；引物合成與序列測(cè)定由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成.

1.2 方法

1.2.1 土曲霉基因組DNA提取

參照CHRISTENSES等的TENS法［6］.

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Kenndy J等報(bào)道的LOVB基因序列，分別設(shè)計(jì)重疊引物：

其中下劃線部分為重疊序列.

1.2.3 重疊PCR擴(kuò)增

LOVB基因4個(gè)外顯子的擴(kuò)增按常規(guī)PCR方法進(jìn)行，純化用DNA凝膠回收試劑盒回收.反應(yīng)體系：外顯子①和外顯子②為模板，10×Buffer 2.5μL，2 mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，2.5U Pfu DNA聚合酶，加雙蒸水至25 mL，在不加引物的條件下，95℃變性30 s，47℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，8個(gè)循環(huán).然后加入0.2μmol P1和P4引物.設(shè)定反應(yīng)條件為95℃30 s，52℃30 s，72℃1.5min，24個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存.同理，LOVB③和LOVB④的拼接程序同上.得到重疊產(chǎn)物L(fēng)OVB①②和LOVB③④純化回收后，以其為模板，延伸時(shí)間為2.5min，引物為P1和P8，其他反應(yīng)條件不變.

1.2.4 PCR產(chǎn)物的連接轉(zhuǎn)化與測(cè)序

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后，用DNA凝膠回收試劑盒將目的片段回收純化，連接于pMDR18-T載體上.將連接好的質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化已制備好的感受態(tài)E.coli JM109.通過(guò)藍(lán)白篩選和菌落PCR初步鑒定后，將陽(yáng)性菌落于37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日收集菌體，送至上海英駿生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序.

2 結(jié)果與分析

2.1 土曲霉基因組DNA的提取結(jié)果

通過(guò)去除蛋白質(zhì)和RNA，獲得了土曲霉的總DNA，大小60 kb左右，和預(yù)測(cè)結(jié)果64 kb相比基本符合.經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1.從圖中可以看到一條清晰明亮的DNA條帶，條帶明顯，無(wú)拖尾現(xiàn)象.說(shuō)明獲得的樣品DNA降解非常少，可用于下步PCR反應(yīng).

2.2 第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別以P1/P2，P3/P4，P5/P6，P7/P8為引物，土曲霉總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.優(yōu)化緩沖液體系、鎂離子濃度和模板DNA的稀釋倍數(shù)等參數(shù)，結(jié)果顯示第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物均為一條特異的DNA條帶，結(jié)果見(jiàn)圖2.泳道1大小為522 bp左右，和外顯子①的大小一致；泳道2大小為213 bp左右，和外顯子②的大小一致；泳道3大小為226bp左右，和外顯子③的大小一致；泳道4大小為342 bp左右，和外顯子④的大小一致.由此可以初步確定擴(kuò)增到洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB的四個(gè)外顯子片段.

2.3 第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別以P1/P4，P5/P8為引物，LOVB①/②，③/④的PCR回收產(chǎn)物為相對(duì)應(yīng)的模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增.優(yōu)化緩沖液體系、鎂離子濃度和模板DNA的稀釋倍數(shù)等參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3.泳道1大小為740 bp左右，和LOVB①②的大小一致；泳道2大小為570 bp左右，和LOVB③④的大小一致.由此可以初步確定擴(kuò)增到洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB的重疊片段①②和③④.

2.4 第三輪PCR擴(kuò)增結(jié)果

以P1/P8為引物，LOVB①②/③④的PCR回收產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.優(yōu)化緩沖液體系、鎂離子濃度和模板DNA的稀釋倍數(shù)等參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4.泳道1，2大小為1 300 bp左右，和LOVB①-④的大小一致.由此可以初步確定擴(kuò)增到洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB的重疊片段①-④.

2.5 重組質(zhì)粒的菌落PCR和序列分析結(jié)果

對(duì)鑒定為陽(yáng)性的菌落進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖6，該序列與NCBI上登陸號(hào)為AF151722.1的洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB的DNA序列進(jìn)行Blast比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)有20個(gè)堿基不同，同源率達(dá)98.5％.

3 討論

他汀類(lèi)藥物是一類(lèi)重要的聚酮類(lèi)化合物［7］，由于聚酮化合物具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，通常我們不能通過(guò)化學(xué)合成的方法來(lái)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，這就意味著通過(guò)發(fā)酵的方式生產(chǎn)具有藥理活性的聚酮類(lèi)化合物將會(huì)成為工業(yè)化生產(chǎn)的唯一途徑.隨著洛伐他汀生物合成酶基因結(jié)構(gòu)與功能研究的不斷深入，通過(guò)異源表達(dá)來(lái)提高其生產(chǎn)水平是近10年來(lái)的主要研究方向.如Kennedy、Park等［5，7-8］利用基因工程技術(shù)將洛伐他汀生物合成基因組中調(diào)節(jié)其合成過(guò)程的編碼基因LovE復(fù)制到一株野生型菌株中，使洛伐汀產(chǎn)量提高了5～7倍.

圖6 序列測(cè)定和分析結(jié)果Fig.6 The results of sequence detrMination and analysis

LOVB基因負(fù)責(zé)合成洛伐他汀生物合成過(guò)程他中的一種重要酶，即洛伐他汀九酮合成酶（LNKS）.本研究應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)，根據(jù)洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB的DNA序列分別設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，擴(kuò)增其4個(gè)外顯子，然后按一定的順序?qū)⑵湟灰黄唇悠饋?lái)，從而獲得了LOVB①-④的cDNA序列，大小1 303 bp，該序列與NCBI上登陸號(hào)為AF151722.1的洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB的DNA序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)有20個(gè)堿基不同，同源率達(dá)98.5％.測(cè)序結(jié)果比對(duì)后有20個(gè)堿基不同，可能原因是因?yàn)槎啻蔚幕厥占兓僮鳎沟媚康钠卧谧贤饩€暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，從而導(dǎo)致部分堿基突變，或者是因?yàn)橹丿BPCR得到的產(chǎn)物不是親本片段通過(guò)直接連接產(chǎn)生，而是通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的復(fù)制品，經(jīng)過(guò)多輪重疊PCR后其保真度會(huì)受到一定程度的影響.

［1］Tobert J A.Lovastatin and beyond：The history of the HMG-CoA reductase inhibitors[J].Nat Rev Drug Discovery，2003，2：517-526.

［2］Manzoni M，Rollini M.Biosynthesis and biotechnological Production of statins by filamentous fungi and application of these cholesterol-lowering drugs[J].APPl Microbiol Biotechnol，2002，58：555-564.

［3］高藍(lán)，李浩明.洛伐他汀生物合成及其相關(guān)基因研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù)，2005，12（3）：201-206.

［4］張驍，束梅英.他汀類(lèi)降血脂藥物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)制藥信息，2001，17（12）：10-18.

［5］Kenndy J，Auclair K，KendreWS G，et al.Modulation of polyketides synthase activity by accessory proteins during lovastatin biosynthesis[J].Science，1999，284：136.

［6］Christense B，F(xiàn)ink J，Merrifield R B，et al.Channel-forming properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes[J].Proc Natl A-cad Sci USA，1988，85：5072-5076.

［7］Julia S，Christian H.Advances in cloning，functional analysis and heterologous expression of fungal polyketide synthase genes[J].Biotechnology，2006，124：690-703.

［8］Park C，Hutchinson C R，Kennedy J.Method of Producing antihypercholesteroleMic agents：USA，2004033570[P]. 2004-02-19.

責(zé)任編輯：黃 瀾

Application of SOE-PCR in the Lovastatin Nonaketide Synthase Gene Cloning

HUANG Zhuo，LI Dongdong*，ZHANG Lin，YAN Shan
（College of Material and Chemical Engineering，Hainnan University，Haikou 570228，China）

In order to verify the application of SOE PCR in the lovastatin nonaketide synthase gene（LovB）cloning，4 couples of primers were designed to amplify 4 exons of LovB，after which the exons can be connected by overlapping PCR one by one to forMthe cDNA sequence of LovB①-④.The results indicated that the exons of LovB①-④ with the size of 1300bp was amplified successfully by overlapping PCR，the sequencing result was blasted with the LovB cDNA sequence titled AF151722.1 in the NCBI，which showed the 98.5％homoeology.

overlapping extension PCR；lovastatin；polyketide synthase；statins

R 392.11

A

1674-4942（2010）03-0300-06

2010-04-13

國(guó)家自然科學(xué)基金（30560092）

*通訊作者