翟芳芳, 張靜, 張建華, 孫付保, 張宏建, 毛忠貴＊

(1.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學生物工程學院,江蘇無錫 214122)

酒精沼氣雙發(fā)酵偶聯(lián)工藝中沼液有機酸對酒精發(fā)酵的影響

翟芳芳1,2, 張靜1,2, 張建華1,2, 孫付保1,2, 張宏建1,2, 毛忠貴＊1,2

(1.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學生物工程學院,江蘇無錫 214122)

木薯酒精蒸餾廢液經(jīng)厭氧沼氣發(fā)酵后的沼液全部回用作為酒精發(fā)酵配料的工藝用水,形成酒精沼氣雙發(fā)酵偶聯(lián)工藝。研究發(fā)現(xiàn),乙酸和丙酸是抑制酒精發(fā)酵的主要的小分子有機酸。乙酸對酒精發(fā)酵產(chǎn)生抑制的有效質量濃度為0.4 g/dL,丙酸對酒精發(fā)酵產(chǎn)生抑制的有效質量濃度為0.1 g/dL,乳酸質量濃度達到2.5 g/dL時才會對酒精發(fā)酵產(chǎn)生影響。

木薯;酒精發(fā)酵;沼氣發(fā)酵;有機酸;抑制

酒精工業(yè)在國民經(jīng)濟中起著重要的作用,酒精不僅廣泛應用于食品、化工、醫(yī)藥、染料、國防等行業(yè),也是一種可再生能源。近年來,世界上已有2/3的酒精被用作燃料[1]。燃料酒精是目前國際上受關注的可再生能源,在汽油或柴油中添加一定比例的燃料酒精,可減少30%以上汽車尾氣排放引起的空氣污染。2006年,中國酒精產(chǎn)量的1/3是以木薯原料生產(chǎn)的。木薯是非糧原料,木薯生產(chǎn)酒精不與人畜爭糧,但每生產(chǎn)1 t木薯酒精約產(chǎn)生7～15 t廢水。該類廢水含有大量的有機物及懸浮物,呈酸性,屬酸性高濃度有機廢水[2]。廢水污染是木薯酒精工業(yè)可持續(xù)發(fā)展中必須解決的問題。

目前酒精廢水處理的一般程式是高濃度有機廢水經(jīng)過厭氧沼氣發(fā)酵、沼液好氧曝氣過程,以求最終達標排放。國家頒布的味精、酒精、醫(yī)藥原料藥、生物制藥、苧麻脫膠、皮革、化纖漿粕工業(yè)等污水排放一級標準的最高允許排放質量濃度為COD 100 mg/L,而木薯酒精蒸餾廢液的COD在(8～10) ×104mg/L。因此,完全達標排放是非常困難的。

為根治木薯燃料酒精廢水污染的難題,作者所在研究室在多年“大宗發(fā)酵清潔生產(chǎn)”研究的基礎上,提出了以“零能耗,零污染”為目標的酒精和沼氣雙發(fā)酵偶聯(lián)的環(huán)形工藝[3]。其關鍵技術之一是酒精發(fā)酵與沼氣發(fā)酵的偶聯(lián)匹配問題,如沼液中小分子有機酸對酵母生長及其酒精發(fā)酵的影響等問題[4-5]。作者對厭氧沼液中主要小分子有機酸對酒精發(fā)酵過程的影響進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

耐高溫型釀酒高活性干酵母:湖北安琪酵母股份有限公司制造;種子培養(yǎng)基:葡萄糖2 g/dL,酵母膏0.85 g/dL,NH4Cl 0.13 g/dL,MgSO4·7H2O 0.01 g/dL,CaCl20.006 g/dL,p H值自然,0.08 MPa滅菌15 min;28℃、100 r/min培養(yǎng)12 h。

1.2 主要原料與試劑

木薯粉:河南天冠酒精廠提供;液化酶(100 000 U/mL):無錫杰能科生物工程有限公司提供;糖化酶(1 300 000 U/mL):無錫杰能科生物工程有限公司提供。

1.3 分析測試方法

1.3.1 失重 稱量法。

1.3.2 總糖、還原糖的測定 費林試劑熱滴定定糖法[6]。

1.3.3 酒精度測定 發(fā)酵液100 mL,加水稀釋一倍后蒸餾,用量筒量取餾出液100 mL,測定其酒度和溫度,查表更正成20℃的酒精度[7]。

1.4 酒精沼氣雙發(fā)酵偶聯(lián)工藝流程

在偶聯(lián)發(fā)酵循環(huán)體系之外,采用木薯原料模擬工業(yè)實際生產(chǎn),原料粉碎后過40目篩,料水比1∶3,按照酒精生產(chǎn)的原料處理方式將木薯粉進行液化和糖化,氮源為尿素,添加量0.3 g/dL,酵母種子經(jīng)活化后接種體積分數(shù)10%,三角瓶中30℃靜止發(fā)酵60 h。

2 結果與分析

2.1 乙酸對酵母生長及酒精發(fā)酵的影響

乙酸是沼氣發(fā)酵中甲烷的主要前體物質,因此在沼液(厭氧消化液)中有少量存在。如果酒精發(fā)酵過程污染乙酸菌,也會有乙酸生成。乙酸會對酵母的生長產(chǎn)生不利的影響。K.C.Tomas報道,在不添加酵母膏等保護劑的基本培養(yǎng)基中,乙酸對酵母的最小抑制質量濃度為0.6 g/dL[8]。

按照酒精發(fā)酵的工藝方法進行液化糖化,發(fā)酵前向發(fā)酵醪液中添加不同量的乙酸,質量濃度梯度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/dL。

如圖1所示,隨著乙酸質量濃度的增大,酒精發(fā)酵受到抑制,酵母開始發(fā)酵的時間推后,即酵母接種后的延遲期延長。當發(fā)酵液中的初始乙酸質量濃度達到0.4 g/dL時,表現(xiàn)出對酵母明顯的抑制作用,0.1 g/dL的乙酸對酵母發(fā)酵沒有明顯的影響。乙酸質量濃度在0.2～0.4 g/dL之間,隨著質量濃度的增大,抑制作用更加明顯。乙酸質量濃度達到0.5 g/dL時,酒精發(fā)酵受到強烈的抑制,接種后酵母生長的延遲期長達24 h。

發(fā)酵液中乙酸達到一定的質量濃度時會抑制酵母的生長,反映在酒精發(fā)酵的前期,發(fā)酵液中的酵母數(shù)量不增加,但酵母還保持自身活性。發(fā)酵液中的總糖不消耗,還原糖在糖化酶的作用下質量濃度不斷升高。當酵母增殖達到一定數(shù)目后,酵母發(fā)酵耗糖及CO2產(chǎn)生速率與不添加乙酸時主酵期的速率近乎相等。這時在添加乙酸的發(fā)酵液中出現(xiàn)一段快速耗糖期。經(jīng)過這段時期,添加乙酸的發(fā)酵液中的殘?zhí)琴|量濃度只是略高于不添加乙酸的發(fā)酵液中的殘?zhí)琴|量濃度。最終發(fā)酵液中的酒精體積分數(shù)表明,一定質量濃度的乙酸不會對酵母的酒精發(fā)酵能力產(chǎn)生抑制,見圖2。

圖1 不同質量濃度乙酸對酒精發(fā)酵的失重(空)及糖耗(黑)的影響Fig.1 Effect of acetic acid on weight loss(open)and sugar(filled)consumption

圖2 不同質量濃度的乙酸對發(fā)酵液終酒精度的影響Fig.2 Effect of acetic acid on the alcohol concentration

2.2 丙酸對酵母生長及酒精發(fā)酵的影響

經(jīng)過一級厭氧沼氣發(fā)酵,雖然會去除80%的COD,但一級出水的COD還是在10 000 mg/L以上,其中含有大量未轉化成沼氣的有機酸(如乙酸、丙酸、丁酸),會對雙發(fā)酵偶聯(lián)工藝中的酒精發(fā)酵造成影響。在這些有機酸中,丙酸對酒精發(fā)酵產(chǎn)生的抑制是比較強烈的。同時丙酸也是沼氣發(fā)酵中一個重要的中間產(chǎn)物,與其他中間產(chǎn)物相比,丙酸向甲烷的的轉化速率是最慢的,它是甲烷發(fā)酵的限制性物質,也是整個雙發(fā)酵偶聯(lián)工藝的限制性物質。

作者對丙酸抑制酒精發(fā)酵的質量濃度進行了研究。按照酒精發(fā)酵的工藝方法進行液化糖化,在發(fā)酵前向發(fā)酵液中添加不同量的丙酸。質量濃度分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g/dL,發(fā)酵過程中的失重及糖耗見圖3。

丙酸對酒精發(fā)酵產(chǎn)生強烈的抑制作用,0.1 g/dL的丙酸對酒精發(fā)酵產(chǎn)生明顯的抑制作用。同時,丙酸表現(xiàn)出來的對酵母生長和酒精發(fā)酵的抑制形式與乙酸一致,即隨著丙酸質量濃度的升高,抑制作用更加明顯。當丙酸質量濃度達到0.25 g/dL時,可將酵母起酵時間延長至16 h。丙酸質量濃度大于0.1 g/dL時,發(fā)酵終點明顯滯后。

2.3 乳酸對酵母生長及酒精發(fā)酵的影響

乳酸是由于酒精發(fā)酵時污染的乳酸菌產(chǎn)生的乳酸脫氫酶使丙酮酸成為受氫體而形成的。作者按照酒精發(fā)酵的工藝流程進行液化糖化,在發(fā)酵前向發(fā)酵液中添加不同量的乳酸,乳酸的添加量分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/dL,見圖4。

乳酸對酵母生長及酒精發(fā)酵的影響比乙酸要弱,當乳酸質量濃度達到2.5 g/dL時才表現(xiàn)出了與對照的差異。并且當乳酸質量濃度達到2.5 g/dL時,并沒有延遲酵母的起酵時間。從失重和糖耗圖中還可以看出,乳酸對酒精發(fā)酵的影響是降低了酵母生長和酒精發(fā)酵的速率,使耗糖速率減慢,對酵母的延遲期并無影響。K.C.Tomas et al曾報道,在基本培養(yǎng)基中,乳酸對酵母的最低抑制質量濃度為2.5 g/dL[9-11]。乳酸對酒精發(fā)酵的抑制情況與乙酸和丙酸不同,對其抑制機理的探究還在進一步的研究中。在酒精沼氣雙發(fā)酵偶聯(lián)工藝中沼液中乳酸的實際質量濃度要遠遠低于2.5 g/dL,因此乳酸在偶聯(lián)工藝中并不是主要的抑制物質。

圖3 不同質量濃度丙酸對酒精發(fā)酵的失重(空)及糖耗(黑)的影響Fig.3 Effect of propionic acid on weight loss(open)and sugar(filled)consumption

圖4 不同質量濃度乳酸對酒精發(fā)酵的失重(空)及糖耗(黑)的影響Fig.4 Effect of lactic acid on weight loss(open)and sugar(filled)consumption

3 討 論

眾所周知,酒精發(fā)酵發(fā)生污染產(chǎn)生有機酸將降低原料轉化率,但有機酸對酵母的生長及其對酒精發(fā)酵的影響報道很少。作者通過以木薯為原料模擬工業(yè)生產(chǎn),著眼于廢水的資源化,對酒精沼氣雙發(fā)酵偶聯(lián)新工藝中的關鍵問題進行了研究。研究發(fā)現(xiàn),小分子有機酸是抑制酒精發(fā)酵進行的主要物質之一。在雙發(fā)酵偶聯(lián)體系中,丙酸是影響最大的有機酸,它對酵母的酒精發(fā)酵產(chǎn)生較大抑制,質量濃度較高時也會抑制沼氣發(fā)酵中甲烷菌的活性。

實驗證明,在實際的木薯原料發(fā)酵液中,乙酸對酒精發(fā)酵產(chǎn)生抑制的有效質量濃度為0.4 g/dL,丙酸對酒精發(fā)酵產(chǎn)生抑制的有效質量濃度為0.1 g/dL,乳酸影響酒精發(fā)酵的有效質量濃度為2.5 g/ dL。小分子有機酸是沼氣發(fā)酵過程的中間產(chǎn)物,也是產(chǎn)生沼氣的重要底物。沼氣發(fā)酵控制不當易偏向丙酸型發(fā)酵,引起丙酸的積累。因此在雙發(fā)酵偶聯(lián)工藝中,控制沼氣發(fā)酵部分穩(wěn)定高效的運行是整個工藝實現(xiàn)的重要前提。

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(責任編輯:李春麗)

Effect of Organic Acid on the Alcohol Fermentation Process Coupling with Biogas Fermentation

ZHAI Fang-fang1,2, ZHANGJing1,2, ZHAN GJian-hua1,2, SUN Fu-bao1,2, ZHANG Hong-jian1,2, MAO Zhong-gui＊1,2
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;
2.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Recycling the stilliage condensates produced into the fermentation phase,coupled with the alcohol fermentation and the anaerobic biogas fermentation.It has been demonstrated that acetic acid and propionic acid exhibited main inhibition effect on the alcohol fermentation.The concentration of acetic acid inhibit alcohol fermentation was 0.4 g/dL and that of propionic acid was 0.1 g/dL.When the lactic acid concentration increase to 2.5 g/dL,a inhibition effect on alcohol process was detected.

cassava;ethanol fermentation;organic acid;inhibition

TQ 920.1

:A

1673-1689(2010)03-0432-05

2009-05-11

國家863計劃項目(2008AA10Z338)。

＊通信作者:毛忠貴(1954-),男,江蘇溧水人,教授,博士生導師,主要從事清潔生產(chǎn)、功能性物質開發(fā)及纖維資源高值轉化方面的研究。Email:maozg@vip.163.com