祝加學(xué) 沈尊理 秦金保 張濤 金羽青 周廣東

快速純化新生大鼠許旺細(xì)胞的新方法

祝加學(xué) 沈尊理 秦金保 張濤 金羽青 周廣東

目的探討一種簡單高效的許旺細(xì)胞純化方法。方法選用3～5 d的SD乳鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，用DispaseⅡ短時(shí)消化去除神經(jīng)外膜和束膜，用復(fù)合膠原酶NB4徹底消化、離心，獲得原代細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到亞融合狀態(tài)后，置于4℃冰箱約5min，收集首先脫壁的許旺細(xì)胞。最后用S100免疫熒光法和流式細(xì)胞儀法鑒定許旺細(xì)胞的純度。結(jié)果通過酶消化法剝脫神經(jīng)外膜和束膜，獲得純度85%以上的原代許旺細(xì)胞；經(jīng)低溫差速法進(jìn)一步純化，純度可達(dá)99%。結(jié)論先用酶消化神經(jīng)外膜和束膜，再用低溫差速分離許旺細(xì)胞，能夠獲得高純度的許旺細(xì)胞，是一種簡便高效的純化手段。

許旺氏細(xì)胞純化低溫

許旺細(xì)胞是重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在中樞和外周神經(jīng)損傷后的修復(fù)中發(fā)揮重要作用[1－4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，許旺細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)可以促進(jìn)干細(xì)胞分化為類神經(jīng)細(xì)胞[5－7]，但是該方法需要高純度的許旺細(xì)胞。有兩種方法可以提高許旺細(xì)胞的純度：一是通過去除神經(jīng)外膜提高原代細(xì)胞的純度；另一種是在培養(yǎng)傳代過程中，采取各種方法去除成纖維細(xì)胞的污染。但是這兩種方法都不能在短時(shí)間內(nèi)獲得高純度的許旺細(xì)胞，而且具有耗資多、效率低等缺點(diǎn)。在提高原代許旺細(xì)胞純度方面，盡管在顯微鏡下剝離去除神經(jīng)外膜，可以減少成纖維細(xì)胞的污染[11]，但是采用目前的設(shè)備技術(shù)，仍然難以達(dá)到徹底去除神經(jīng)束膜的目的。乳鼠許旺細(xì)胞的增殖能力較成年鼠強(qiáng)，且取材容易，是許旺細(xì)胞研究的主要細(xì)胞來源，但是因?yàn)槠渖窠?jīng)細(xì)小，更難通過顯微技術(shù)去除外膜。而在許旺細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增過程中，主要的困難就是成纖維細(xì)胞的污染。針對這一問題，目前仍以有絲分裂抑制劑抑制成纖維細(xì)胞分裂法和酶消化差速貼壁法為主[8-10]。但是，有絲分裂劑對細(xì)胞的有絲分裂缺乏針對性，同樣也會抑制處于分裂旺盛期的許旺細(xì)胞增殖；酶消化差速貼壁法只是在培養(yǎng)傳代過程中減少成纖維細(xì)胞的污染，需要反復(fù)多次純化才能得到高純度的許旺細(xì)胞，因此酶消耗大、步驟繁瑣且耗時(shí)較長。

本研究嘗試先用DispaseⅡ酶消化法，去除乳鼠神經(jīng)束膜和外膜，膠原酶消化分離獲得原代細(xì)胞，再用低溫差速分離法進(jìn)一步純化，從原代和傳代兩個(gè)層面純化，以期在短時(shí)間內(nèi)獲得高純度的許旺細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 動物

新生SD乳鼠（3～5日齡，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司）18只。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)瓶的鋪層

在培養(yǎng)瓶內(nèi)加入含400 ng/mL層粘連蛋白（LN，羅氏公司）的DMEM溶液（100μl/cm2），水平振蕩培養(yǎng)瓶至液體均勻鋪滿瓶底，將培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，吸除液體后備用。

1.2.2 許旺細(xì)胞培養(yǎng)液的配制

許旺細(xì)胞培養(yǎng)液（Schwann cellsculturemedia，SCCM），含10%胎牛血清（FBS，Hyclone公司）的DMEM溶液，加入1mM左旋谷氨酰胺（Sigma公司）、2μM Forskolin（Sigma公司）、1 ng/mLHeregulin-β-1（Pepro Tech公司），混勻后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 原代許旺細(xì)胞的獲取

取新生3～5 d的小鼠，脫臼處死后，在75%乙醇內(nèi)浸泡消毒15min。在解剖顯微鏡下手術(shù)獲取雙側(cè)坐骨神經(jīng)（SN），將SN浸入裝有40mLPBS的50mL離心管中，冰上孵育待用。SN獲取完畢后，600 g離心，負(fù)壓吸除PBS，加入1 mL 0.2%DispaseⅡ，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃孵育30min。輕輕搖晃試管，使SN呈絲狀，自然沉淀后，吸去消化液（將消化液進(jìn)行離心，所獲細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶中），PBS清洗1次，離心獲得絲狀的神經(jīng)組織。加入0.2%復(fù)合膠原酶NB4放置30 min，徹底消化神經(jīng)組織，用巴氏管反復(fù)吹打2～5min，至組織塊呈細(xì)微碎片（此時(shí)消化液較混濁，無明顯大組織塊）。600 g離心5 min，棄上清，加入SCCM重懸至（2.0～2.5）×105cells/mL，接種入LN鋪盤后的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

1.2.4 許旺細(xì)胞的純化與擴(kuò)增

原代細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)瓶放入4℃冰箱中，約5min后取出，輕輕拍打培養(yǎng)瓶壁1～3min，使許旺細(xì)胞脫離瓶壁入培養(yǎng)液中。收集懸液入15mL離心管，600 g離心5min，棄上清，加入SCCM，重懸細(xì)胞。1∶1接種于新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5 許旺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定

在培養(yǎng)瓶中，許旺細(xì)胞形態(tài)較特異，胞體細(xì)長呈梭形、雙極或三極、核漿比例小、折光性強(qiáng)，較易與胞體扁平不規(guī)則形、核漿比例較大、折光性差的成纖維細(xì)胞鑒別。此外，在體外培養(yǎng)中，相鄰的許旺細(xì)胞會首尾相連，形成鏈狀或網(wǎng)狀的特異形態(tài)，而成纖維細(xì)胞則相互融合呈片狀。

1.2.6 許旺細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

許旺細(xì)胞特異性表達(dá)S100β蛋白，可用以鑒定SC。負(fù)壓吸除SCCM，加入0.05%Trypsin-EDTA消化1min，F(xiàn)BS終止消化。600 g離心5min，棄上清，加適量SCCM，重懸細(xì)胞至（2.0～2.5）×106cells/mL。將細(xì)胞懸液滴于載玻片上，每張100μL，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30～40min后，加入適量SCCM培養(yǎng)24～48 h。負(fù)壓吸除SCCM，4%多聚甲醛溶液于室溫下固定5min。PBS漂洗3次，每次3min。10%羊血清室溫封閉10min。加入兔抗S100抗體（1∶500），37℃孵育60min或4℃過夜。PBS漂洗3次，每次5min。加入CY3-羊抗兔IgG抗體（1∶200），37℃孵育30min。PBS漂洗3次，每次5min。DAPI核襯染10 s，PBS漂洗5min。熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍攝。

1.2.7 流式細(xì)胞儀鑒定許旺細(xì)胞的純度

負(fù)壓吸除培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液，PBS漂洗1次后加入3～4mL的0.05%Trypsin-EDTA，至大多數(shù)細(xì)胞收縮變圓、透亮?xí)r即加入30μL FBS（或含有10% FBS的培養(yǎng)液3mL）終止消化。將液體經(jīng)40μm濾網(wǎng)過濾后，收集入50 mL離心管，600 g離心5 min，棄上清；用含4%FCS的PBS重懸至1.0×107cells/mL，每100μL分裝入一支15mL離心管中；分別加入兔抗P75（1∶500），4℃下避光孵育30 min。分別加入含4%FCS的PBS漂洗，600 g離心5min，棄上清，重復(fù)漂洗3次。用100μL含4%FCS的PBS重懸細(xì)胞，加入二抗FITC-羊抗兔IgG抗體（1∶500，PBS稀釋），4℃下避光孵育30min。分別加入10mL含4%FCS的PBS漂洗，600 g離心5 min，棄上清，重復(fù)漂洗3次。用含4%FCS的PBS重懸細(xì)胞，冰上孵育待測。

1.2.8 細(xì)胞計(jì)數(shù)

取每次純化所得的細(xì)胞懸液各20μL，以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，此時(shí)獲得的為純化后所得的細(xì)胞量。第60小時(shí)，用0.05%Trypsin-EDTA消化1～3 min，以獲得所有的貼壁細(xì)胞；細(xì)胞懸液收集后，取20μL用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，此時(shí)所得為最終的細(xì)胞獲得量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每次實(shí)驗(yàn)種6瓶細(xì)胞，3瓶一組，共進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。原代細(xì)胞與純化后的第1代細(xì)胞進(jìn)行純度比較，計(jì)數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.01為差異具有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 許旺細(xì)胞的獲取與原代培養(yǎng)

經(jīng)酶及機(jī)械消化后，所獲得的細(xì)胞接種于LN鋪盤后的培養(yǎng)瓶，6 h后即見絕大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)貼壁。隨著進(jìn)一步培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞逐漸伸展，最終形成兩類形態(tài)各異的細(xì)胞：一類為許旺細(xì)胞，胞體較小，呈梭形，雙極或三極，核漿比例小，胞核橢圓形，胞體折光性強(qiáng)；另一類為成纖維細(xì)胞，細(xì)胞較大，呈扁平多邊或不規(guī)則形，核漿比例大，胞核圓而大，胞體折光性差。在前48 h的培養(yǎng)過程中，許旺細(xì)胞的分裂速度明顯快于成纖維細(xì)胞；72 h后，成纖維細(xì)胞增殖加快，并迅速成為優(yōu)勢生長的細(xì)胞而鋪滿瓶底，此時(shí)多數(shù)許旺細(xì)胞被迫遷移并重疊到成纖維細(xì)胞的上方。上清液離心所獲得細(xì)胞中以成纖維細(xì)胞為主，只有極少量許旺細(xì)胞（圖1）。

圖1 原代細(xì)胞的顯微鏡下觀察（綠色箭頭所示為許旺細(xì)胞，紅色箭頭所示為成纖維細(xì)胞）

2.2 許旺細(xì)胞的純化

將培養(yǎng)瓶置于4℃冰箱中約5 min后，倒置相差顯微鏡下觀察：大多數(shù)雙極和三極的細(xì)胞收縮，折光性明顯增加；而成纖維細(xì)胞則形態(tài)學(xué)改變不明顯并貼壁牢固。輕輕拍打瓶壁1～3min，見大多數(shù)許旺細(xì)胞浮起，而成纖維細(xì)胞仍然貼壁完好（圖2）。

圖2 純化過程中細(xì)胞的顯微鏡下觀察（綠色箭頭所示為許旺細(xì)胞，紅色箭頭所示為成纖維細(xì)胞）

2.3 許旺細(xì)胞的鑒定

經(jīng)體外繼續(xù)培養(yǎng)的許旺細(xì)胞，在3 d后大多排列成鏈狀或網(wǎng)狀。經(jīng)S100β蛋白的免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的雙極及三極樣細(xì)胞為陽性，而殘余的扁平圓核不規(guī)則細(xì)胞均為陰性（圖3）。

圖3 細(xì)胞的免疫熒光染色（40×）（綠色箭頭所示為許旺細(xì)胞，白色箭頭所示為成纖維細(xì)胞）

2.4 許旺細(xì)胞的純度鑒定

原代許旺細(xì)胞貼壁24 h，許旺細(xì)胞的純度為85%；原代細(xì)胞培養(yǎng)48 h，經(jīng)過進(jìn)一步純化后，再次貼壁24 h，許旺細(xì)胞的純度為99.6%（圖4）。

圖4 實(shí)驗(yàn)組和對照組的流式細(xì)胞檢測

2.5 細(xì)胞擴(kuò)增計(jì)數(shù)

重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，二次純化所得的許旺細(xì)胞純度均高于99%。第1代細(xì)胞的純度均顯著高于原代，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

許旺細(xì)胞的體內(nèi)、外研究及組織工程化神經(jīng)導(dǎo)管的構(gòu)建都需要制備高純度的許旺細(xì)胞[2，4]，而且高純度許旺細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)可誘導(dǎo)出類神經(jīng)元[5－7]。然而，在許旺細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，成纖維細(xì)胞的優(yōu)勢生長一直都是制約許旺細(xì)胞體外培養(yǎng)純化的主要因素。盡管目前已有許多許旺細(xì)胞的純化方法，如無血清或低血清培養(yǎng)法[12]、抗有絲分裂處理結(jié)合胰酶差速消化法[13]、免疫選擇法、復(fù)合膠原酶差速消化法及體外預(yù)變性結(jié)合復(fù)合膠原酶差速消化法[9－10]等，然而這些方法各有缺點(diǎn)。無血清或低血清培養(yǎng)法，不僅降低成纖維細(xì)胞的增殖，許旺細(xì)胞的增殖也明顯受到抑制?？褂薪z分裂劑，非特異地作用于所有的進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞，因而在減少快速增殖的成纖維細(xì)胞的同時(shí)，也抑制了處于有絲分裂旺盛期的許旺細(xì)胞增殖。免疫選擇法，需要大量抗體及大型分選設(shè)備，增加了細(xì)胞污染的概率，耗費(fèi)資金較多[14]。而各類消化酶差速消化法及體外預(yù)變性的方法，大多費(fèi)時(shí)較長，難以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量高純度的許旺細(xì)胞。

我們通過DispaseⅡ初步消化神經(jīng)，去除神經(jīng)外膜和束膜，可獲得相對較高純度的原代許旺細(xì)胞，再利用許旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對低溫作用的不同反應(yīng)，通過降低培養(yǎng)瓶內(nèi)的溫度，促使許旺細(xì)胞首先脫壁，進(jìn)一步純化許旺細(xì)胞，可使許旺細(xì)胞的純度達(dá)到99%以上。采用以上方法，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得高純度的許旺細(xì)胞，且較經(jīng)濟(jì)方便。為驗(yàn)證DispaseⅡ?qū)ι窠?jīng)外膜和束膜的消化具有特異性，我們將首次酶消化過程中獲得的混合液離心，所得細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有少量許旺細(xì)胞，因此DispaseII對神經(jīng)段的消化，不會造成許旺細(xì)胞的大量丟失。在純化原代許旺細(xì)胞過程中，需要嚴(yán)格控制培養(yǎng)瓶放置入冰箱的時(shí)間：作用時(shí)間過短，許旺細(xì)胞不脫壁；而作用時(shí)間過長，成纖維細(xì)胞也會大量脫壁，達(dá)不到純化目的。我們發(fā)現(xiàn)，作用5min左右比較合適。

綜上所述，我們用DispaseⅡ消化去除神經(jīng)外膜和束膜，可以獲得高純度的原代許旺細(xì)胞，首次傳代時(shí)再用低溫差速分離法進(jìn)一步純化，在48 h內(nèi)就能獲得滿足需要的高純度許旺細(xì)胞。

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A Novel Approach to Rapid and High-efficiency Purification of Schwann Cells in Rats

ZHU Jiaxue1,SHEN Zunli1, QIN Jinbao1,ZHANG Tao2,JIN Yuqin1,ZHOU Guangdong3.
1 Department of Plastic Surgery,Shanghai First People′s Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200080,China;2 Department of Gynaecology and Obstetrics,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200111,China;3 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai200111,China.Corresponding author:SHEN Zunli.

ObjectiveTo explore a simplemethod for high-purity enrichmentof Schwann cells(SCs).M ethodsThe sciatic nervewas dissected from both limbs of the neonatal Sprague-Dawley(SD)rat(3－5 days old).The nervewas first digested by dispaseⅡto remove epineurium and perineurium,and then by collagenase NB4 to obtain primary SCs.The cells were centrifuged and cultured until confluence in a flask.Then the flask was placed in refrigerator(4℃)for 5 minutes.At such a low temperature,SCsmostly detached from the innerwall,while the other cells remained adherent.The SC purity was identified by S100 immunofluorescence double staining and flow cytometry.ResultsThe purity was above 85%after enzyme digestion,and reached 99%after low-temperature treatment.ConclusionEnzyme digestion in conjunction with low temperature treatment is a simple and efficientway to obtain Schwann cellswith high purity.

Schwann cells;Purification;Low-temperature

book=141,ebook=5

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）03－0141－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.03.005

2010年3月16日；

2010年3月23日)

國家自然科學(xué)基金（30872630）。

200080上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院整形外科（祝加學(xué)，沈尊理，秦金保，金羽青）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（張濤）；整復(fù)外科（周廣東）。

沈尊理。