侯影飛,王增林,張 建,郭 寧,孔 瑛

(1.中國(guó)石油大學(xué)重質(zhì)油國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266555; 2.中石化勝利油田博士后科研工作站,山東東營(yíng) 257015)

固定化對(duì)柴油生物脫硫菌UP-1性能的影響

侯影飛1,2,王增林2,張 建2,郭 寧1,孔 瑛1

(1.中國(guó)石油大學(xué)重質(zhì)油國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266555; 2.中石化勝利油田博士后科研工作站,山東東營(yíng) 257015)

為獲得穩(wěn)定高效生物脫硫催化劑,采用海藻酸鈉(SA)包埋法制備生物脫硫菌UP-1的固定化細(xì)胞,使用環(huán)鏡掃描電鏡(ESE M)對(duì)固定化細(xì)胞進(jìn)行分析和表征。結(jié)果表明:固定化細(xì)胞可以重復(fù)使用 5次以上,而未固定化細(xì)胞只能有效重復(fù)使用 2～3次;固定化小球內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、表面的致密表層和固定化細(xì)胞初始階段存在覆蓋物,說明 SA是固定UP-1的合適載體,反應(yīng)底物和產(chǎn)物在固定化載體中的傳質(zhì)阻力增加和包埋材料對(duì)UP-1的初始覆蓋導(dǎo)致了固定化UP-1脫硫活性的降低;最佳條件下得到的固定化細(xì)胞菌體在載體內(nèi)部均勻飽和分布,這從微觀結(jié)構(gòu)上證明固定化可以提高生物催化劑總脫硫能力和穩(wěn)定性。

微生物學(xué);固定化細(xì)胞;生物脫硫;環(huán)境掃描電鏡;施氏假單胞菌UP-1

對(duì)于雜環(huán)類含硫化合物如二苯并噻吩(DBT)等由于受空間位阻的影響,常用的脫硫技術(shù)較難脫除,近年來迅速發(fā)展的生物脫硫技術(shù)可以選擇性地脫除此類硫化物[1-3]。20世紀(jì) 60年代出現(xiàn)的固定化生物催化劑技術(shù),通過再生活化能夠顯著提高生物催化劑的使用壽命,保持生物催化劑的原始狀態(tài),有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性,避免細(xì)胞的流失,簡(jiǎn)化了反應(yīng)體系的后續(xù)分離過程,可以有效解決酶或細(xì)胞作為高效生物催化劑存在的穩(wěn)定性差、與產(chǎn)品分離困難、容易流失的問題[4-7]。筆者采用包埋法對(duì)生物脫硫菌 Pseudom onas stutzeriUP-1進(jìn)行固定化研究,使用環(huán)境掃描電鏡(ESEM)[8-10]對(duì)固定化細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)和表征,分析固定化對(duì)生物脫硫菌性能的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌種及細(xì)胞培養(yǎng)

菌種為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的脫硫菌 Pseudom onas stutzeriUP-1(ZL03156758.4)[11]。將菌種UP-1接種于 50 mL新鮮桑特斯培養(yǎng)基[12]的 250 mL錐形瓶中,放入轉(zhuǎn)速為 200 r/min、溫度為 31℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)一定時(shí)間。然后利用冷凍高速離心機(jī) (-4℃,10 kr/min,20 min)將菌體從培養(yǎng)液中分離,將得到的UP-1菌體用磷酸鹽緩沖液洗滌 3～5次,再用生理鹽水洗滌 1次,備用。

1.2 固定化細(xì)胞制備

將收集的細(xì)菌菌體加入溶解好的 3%海藻酸鈉(Sodium alginate,簡(jiǎn)稱 SA)膠液中,混合均勻,攪拌狀態(tài)下用注射器滴入 4℃交聯(lián)劑中成球。

1.3 固定化細(xì)胞脫硫?qū)嶒?yàn)

以二苯并噻吩(DBT)作為模型化合物進(jìn)行脫硫?qū)嶒?yàn)。

水體系脫硫?qū)嶒?yàn):準(zhǔn)確稱量一定量的DBT放入250 mL的三角瓶中,高壓蒸汽滅菌后,用微量的DMF將其溶解分散,再加入 50 mL滅菌水,得到水反應(yīng)體系。然后稱量 0.625 g菌體當(dāng)量的固定化細(xì)胞加入瓶中,放進(jìn)恒溫?fù)u床最佳溫度下反應(yīng)。用40.0 mL正己烷萃取反應(yīng)體系中的硫化物,正己烷中的硫含量可以利用氣相色譜和微庫(kù)侖綜合分析儀測(cè)定,根據(jù)降解前后DBT的質(zhì)量濃度計(jì)算脫硫率。

模擬油 -水體系的脫硫?qū)嶒?yàn):將DBT溶于十二烷作為模擬柴油,DBT質(zhì)量濃度為 500 mg/L,水相體積為 50 mL,油水比為3∶10,加入 1.0 mL傳質(zhì)助劑,恒溫?fù)u床最佳溫度下反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束,先將固定化細(xì)胞與反應(yīng)混合液分離,反應(yīng)混合液再離心,測(cè)定油相DBT質(zhì)量濃度,分析降解效果。

1.4 固定化細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察

固定化細(xì)胞先經(jīng)過液氮速凍 15 min,迅速放入冷凍干燥機(jī),于 -45℃下干燥24 h,然后使用 ESEM進(jìn)行檢測(cè)表征?；蛘咧苯訉⒅苽涞玫降暮潭ɑ?xì)胞風(fēng)干表面水分,在低真空度下使用 ESEM進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察、表征。

2 結(jié)果分析

2.1 固定化載體交聯(lián)后結(jié)構(gòu)

ESEM樣品室為低真空 (大于 12.7 kPa),含水樣品不必經(jīng)過傳統(tǒng)的脫水、干燥和噴鍍金屬導(dǎo)電層等處理,可直接在較高的加速電壓下觀察,省卻了繁雜的制樣過程,使含水樣品的觀察研究變得極為方便,消除了因樣品處理而造成的人為假象。圖 1是SA小球的 ESEM照片。從圖 1(a)的沉淀后 SA小球濕態(tài) ESEM照片可以看出,載體通過交聯(lián)沉淀形成了格子型內(nèi)部結(jié)構(gòu),這種網(wǎng)狀微細(xì)結(jié)構(gòu)有利于細(xì)菌的包埋和附著,在有效包埋UP-1細(xì)胞的同時(shí)提供充足水分。圖1(b)是 SA小球經(jīng)冷凍干燥后的斷面ESEM照片,可見,雖然經(jīng)過液氮速凍和冷凍干燥后存在變形,但其斷面照片清楚顯示了其格子狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu),適合固定化微生物細(xì)胞。圖 1(c)表明 SA小球外表面沒有UP-1細(xì)胞出現(xiàn),圖 1(d)表明固定化小球表面存在致密層(厚度 30～35μm)、內(nèi)部存在大孔道,此層極薄的致密球殼可以有效地防止顆粒內(nèi)部菌體的外流[13],內(nèi)部大孔道有利于底物、產(chǎn)物和溶氧的傳遞。綜上可見,SA是一種較為理想的包埋材料。

圖1 不同狀態(tài)和部位的 SA小球 ESEM照片F(xiàn)ig.1 ESEM pictures of SA spherule under different state and position

2.2 固定化細(xì)胞質(zhì)量濃度的選擇

圖 2是細(xì)胞濃度對(duì)固定化細(xì)胞降解 DBT效果的影響曲線。菌體質(zhì)量濃度大于 0.048 g/mL之后,隨著菌體質(zhì)量濃度的增加,降解率的增長(zhǎng)并不明顯。圖 3為固定化細(xì)胞內(nèi)部 ESEM照片?？梢钥闯?菌體質(zhì)量濃度為 0.05 g/mL時(shí),UP-1細(xì)胞分布均勻,接近均勻飽和分布(均勻飽和分布是指菌體在載體內(nèi)分布緊湊均勻、不重疊、不堆積);菌體質(zhì)量濃度為 0.025 g/mL的固定化細(xì)胞內(nèi)部,菌體分散不均勻,達(dá)不到均勻飽和分布。脫硫?qū)嶒?yàn)和 ESEM檢測(cè)一致證明,固定化細(xì)胞中菌體質(zhì)量濃度為 0.048 g/ mL是最合適的。

2.3 固定化對(duì) UP-1在水體系中脫硫性能的影響

圖 4是固定化前、后 UP-1對(duì) DBT降解曲線?？梢?細(xì)菌UP-1固定化以后,其脫硫活性明顯降低,脫硫速率變慢。未固定化細(xì)胞和固定化細(xì)胞分別在反應(yīng)時(shí)間為 20和 120 h之前,具有相對(duì)較快的反應(yīng)速率,之后,反應(yīng)速率趨于平穩(wěn),降解率的增加不明顯。這是由微生物反應(yīng)過程中存在反饋抑制作用和擴(kuò)散效應(yīng)造成的[14]。當(dāng)反應(yīng)開始時(shí),酶體系活性較高,底物含量高,反饋抑制作用小,反應(yīng)速率較快,擴(kuò)散推動(dòng)力大,產(chǎn)物較容易擴(kuò)散到載體外的水相中,所以降解率增加較快;隨著底物含量下降,產(chǎn)物含量增加,反饋抑制作用加強(qiáng),反應(yīng)速率下降,同時(shí)傳質(zhì)推動(dòng)力降低,導(dǎo)致降解效果趨于恒定。

使用前、后固定化小球干燥后 ESEM照片見圖5?？梢钥闯?使用后的固定化小球內(nèi)部交聯(lián)層的厚度明顯增加,表面變得模糊和粗糙,可能是沒有擴(kuò)散出來的反應(yīng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物沉積所致,這也證明了擴(kuò)散效應(yīng)對(duì)DBT降解反應(yīng)影響較大,是固定化細(xì)胞脫硫效率下降的一個(gè)主要因素。結(jié)合圖 1(d)發(fā)現(xiàn)的固定化小球存在的致密層,可以認(rèn)為反應(yīng)物和產(chǎn)物的擴(kuò)散阻力在致密層最大,致密層的存在也是固定化細(xì)胞脫硫速率顯著降低的主要原因之一。

圖 6 使用前、后固定化 UP-1細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 I nternalm icrostructure of used and unused UP-1 i mmobilized cells

圖 6是固定化細(xì)胞使用前、后內(nèi)部細(xì)胞狀態(tài)變化照片。使用前菌體表面有覆蓋物,而使用后細(xì)胞清晰,說明在使用過程中,被包埋的菌體能夠擺脫部分覆蓋物而與底物接觸,從而能夠催化DBT降解反應(yīng)。在考察時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)量并沒有明顯變化,表明所選擇的載體能夠?qū)⒚摿蚓?UP-1牢固地包埋固定,沒有出現(xiàn)大量增殖或流失。UP-1細(xì)胞表面存在包埋材料的覆蓋,在初始階段阻礙了DBT和UP-1細(xì)胞的接觸,導(dǎo)致了其脫硫速率降低,但是覆蓋物的厚度 (圖 6)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于表皮致密層 (圖 1)的厚度,因此菌體表面的覆蓋物是脫硫速率降低的次要影響因素。

2.4 固定化對(duì) UP-1在水體系中使用性能的影響

表 1是UP-1的固定化前、后脫硫細(xì)胞的重復(fù)使用情況。可以看出:開始階段未固定化細(xì)胞的對(duì)DBT的降解率高,脫硫速率高,但其使用壽命太短;固定化細(xì)胞效果十分穩(wěn)定,脫硫效率只是稍有下降;相對(duì)于單位質(zhì)量的生物催化劑,DBT的加入量為 500 mg/L時(shí),固定化細(xì)胞的總脫硫能力 (降解 DBT總量)為62.5 mg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于未固定化細(xì)胞的 35.42 mg?？梢哉J(rèn)為,固定化對(duì)微生物的本質(zhì)特性沒有影響或影響很小,但其催化脫硫穩(wěn)定性有了較大提高。

表 1 UP-1未固定化和固定化細(xì)胞穩(wěn)定性比較Table 1 Stability comparison of non-i mmobilized and i mmobilized cell

2.5 固定化對(duì) UP-1在模擬油 水體系中脫硫性能的影響

UP-1固定化前、后在不同油水比下脫硫性能見表2(反應(yīng)時(shí)間均為72 h,模擬油DBT質(zhì)量濃度為500 mg/L)。由表 2可以看出,無論是UP-1固定化細(xì)胞還是未固定化細(xì)胞,最優(yōu)脫硫效果對(duì)應(yīng)的油水比均是1∶8,隨著油水比的降低,降解率都趨向于升高,兩者脫硫性能差別不大?？梢娫谀M油體系中底物DBT在油水之間傳遞速率受到了限制,在一定程度上抵消了底物擴(kuò)散對(duì)固定化細(xì)胞脫硫速率的影響,導(dǎo)致兩者在模擬油體系中的脫硫性能相差較小。

表 2 固定化對(duì) UP-1在模擬油 水體系中脫硫性能的影響Table 2 I nfluence of immobilization on desulfurization performance in modeling oil-water system

2.6 固定化對(duì) UP-1在模擬油 水體系中使用性能的影響

在模擬油 -水體系中未固定化細(xì)胞 48 h脫硫率即達(dá)到穩(wěn)定,而固定化細(xì)胞最佳脫硫時(shí)間是 100 h,在各自最佳脫硫反應(yīng)時(shí)間下進(jìn)行了二者重復(fù)使用性能的考察,結(jié)果見圖 7。實(shí)驗(yàn)油水比為1∶8,活化是在0.9%NaCl溶液中進(jìn)行的。菌株UP-1未固定化細(xì)胞對(duì)DBT的降解能力在第 1次降解實(shí)驗(yàn)結(jié)束后就急劇下降,第 3次降解實(shí)驗(yàn)基本上就失去了脫硫活性,重復(fù)使用性能很差。雖然固定化細(xì)胞最高脫硫率(55%左右)低于未固定化細(xì)胞(62%左右),但是固定化細(xì)胞在模擬油 -水體系的脫硫性能穩(wěn)定,在重復(fù)使用了 5次之后脫硫性能才有明顯下降。這說明固定化之后細(xì)胞在模擬油 -水體系的脫硫活性穩(wěn)定性得到了提高。

圖 7 固定化對(duì) UP-1在模擬油 水體系中穩(wěn)定性的影響Fig.7 Influence of immobilization on stability in modeling oil-water system

3 結(jié) 論

(1)利用環(huán)境掃描電鏡可以清楚的觀察到含水固定化小球內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和表面的致密表層,也可以清晰觀察到脫硫菌體在固定化載體中的分布狀態(tài)。

(2)SA是石油生物脫硫菌 Pseudom onas stutzeri UP-1合適的固定化載體,反應(yīng)底物和產(chǎn)物在固定化載體中的傳質(zhì)阻力主要集中在致密表層;最佳條件下(SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3%時(shí),細(xì)菌固定化質(zhì)量濃度為0.048 g/mL)得到的固定化細(xì)胞菌體在載體內(nèi)部均勻飽和分布,不出現(xiàn)重疊和累積,固定化載體形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和含水大通道,有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散。

(3)相對(duì)于生長(zhǎng)細(xì)胞,固定化降低了 UP-1的脫硫活性,但提高了其總脫硫能力和脫硫性能的穩(wěn)定性,UP-1固定化細(xì)胞在水體系和模擬油-水體系均可以有效重復(fù)使用 5次以上,而未固定化細(xì)胞只能有效重復(fù)使用 2～3次。脫硫菌UP-1固定化之后活性降低的原因,一是固定化小球存在的致密層加大了反應(yīng)物和產(chǎn)物的擴(kuò)散阻力,二是包埋材料對(duì)UP-1的初始覆蓋阻礙了反應(yīng)底物與細(xì)胞的快速有效接觸。

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(編輯 劉為清)

Influence of i mmobilization on performance of diesel biodesulfurizing bacterium UP-1

HOU Ying-fei1,2,WANG Zeng-lin2,ZHANG Jian2,GUO Ning1,KONG Ying1
(1.State Key Laboratory of Heavy O il Processing in China University of Petroleum,Q ingdao266555,China; 2.W ork Station of Post-Doctoral,Shengli O ilfield,SINOPEC,Dongying257015,China)

In order to get stable and efficient biodesulfurization catalyst,immobilization of pseudomonas stutzeriUP-1 was investigated.The immobilization cellsof biodesulfurization bacteriaUP-1were prepared by sodium alginate(SA)embedmethod. Immobilized cellswere analyzed and characterized by using environmental scanning electron microscope(ESE M).The results show that the prepared immobilized cells can be used repeatedly and effectively 5 times,and the unimmobilized cells(UN IC) just can be effectively used 2-3 times.The internal reticular formation,dense surface layerof immobilized cells and cover existing in immobilized cells initial stage show that SA is a suitable carrier of i mmobilization forUP-1.The increase of transport resistance of reaction substrate and product in the immobilized-carrier and the initial cover of embed material overUP-1 result in the decrease of immobilizedUP-1 desulfurization ability.Under the optimum conditions,the distribution of cells is uniform and saturated.The i mmobilization can improve the total desulfurization ability and stability of biodesulfurization catalyst.

microbiology;immobilization cell;biodesulfurization;environmental scanning electron microscope;pseudomonas stutzeriUP-1

Q 819

A

10.3969/j.issn.1673-5005.2010.04.031

1673-5005(2010)04-0157-05

2010-04-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20676128)

侯影飛(1977-),男(漢族),安徽阜陽(yáng)人,講師,博士,博士后,研究方向?yàn)樯锘ず头蛛x工程。