李霞

（湖南省湘潭市第二人民醫(yī)院藥劑科，湖南湘潭 411100）

四黃瀉火片、麻仁丸中非法添加土大黃苷檢測方法的建立

李霞

（湖南省湘潭市第二人民醫(yī)院藥劑科，湖南湘潭 411100）

目的：建立四黃瀉火片、麻仁丸中非法添加土大黃的檢測方法。方法：采用薄層色譜法（TLC）結(jié)合高效液相色譜法（HPLC）快速鑒別。結(jié)果：該薄層色譜法鑒別法（TLC）加高效液相色譜法（HPLC）穩(wěn)定性和重復性好。結(jié)論：TLC結(jié)合HPLC簡便、快速、專屬性強，能有效地檢查四黃瀉火片、麻仁丸中是否摻入土大黃。

四黃瀉火片；麻仁丸；土大黃苷；薄層色譜法；高效液相色譜法

四黃瀉火片、麻仁丸中均含有大黃成分，按照標準檢驗[1-3]，結(jié)果符合規(guī)定，但在檢驗過程中，發(fā)現(xiàn)薄層斑點異常，研究其處方成分并調(diào)用參照樣品進行陰性對照，懷疑該品種摻入了土大黃。土大黃主要成分是土大黃苷。土大黃苷為二苯乙烯的衍生物，存在于劣質(zhì)大黃中[4-5]。為了有效杜絕摻偽，本文建立了快速篩查四黃瀉火片、麻仁丸是否非法摻偽土大黃的薄層鑒別方法，并用HPLC法予以確證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器和設(shè)備

島津LC-20A高效液相色譜儀，SPD－M20A檢測器，LC-solution色譜工作站，梅特勒-托利多AG135型天平（德國Sartorius），CTO－10AS 柱溫箱，KQ2200E 型超聲波清洗器；10×20 cm硅膠G薄層層析板（青島海洋化工廠分廠，20081211）[6-7]。

1.2 試劑

乙腈為色譜級；其他試劑為分析純；純化水（自制）。

1.3 試藥

供試品：四黃瀉火片，麻仁丸。

參照樣品粉末：按標準中提供的處方及制法制備。陰性樣品粉末：按標準中提供的處方，去大黃后依法制備。土大黃苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號794-200103）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC法

2.1.1 溶液的配制

陰性樣品溶液的制備：取陰性樣品粉末約1 g，照供試品溶液的制備項下的方法制備。

參照樣品溶液的制備：取參照樣品粉末約1 g，照供試品溶液的制備項下的方法制備。

對照品溶液制備：精密稱取土大黃苷對照品1 mg，加甲醇5 ml使溶解，制成濃度0.2 mg/ml的溶液。

2.1.2 薄層色譜條件

硅膠G薄層層析板（10×20 cm）；展開劑：三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）；點樣量：10 μl；溫度：24℃；相對濕度：52%。 三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開后，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。

2.1.3 方法

分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μl，觀察。

2.1.4 試驗結(jié)果

抽屜原理是將需要討論的元素按一定特質(zhì)分類，當取出足夠多的元素時，再運用抽屜原理將范圍縮小，從而推導出屬于同一類的某幾種元素，它們均同時具備某種特質(zhì)，由此推導出題目的結(jié)論。運用抽屜原理時通常會出現(xiàn)以下幾個特點：第一、題目中所討論的元素具備任意性；第二、題目的結(jié)論至少要有一類是具備某種特質(zhì)的，是一個存在性命題；第三、結(jié)論不需要確定，但需存在。

四黃瀉火片與麻仁丸供試品溶液所顯主斑點的顏色呈亮藍色，與土大黃對照品溶液的一致；測定斑點位置時，RF為0.65，與土大黃對照品一致。而參照樣品溶液所顯主斑點的顏色和位置與土大黃苷對照品溶液的不一致（圖1），提示四黃瀉火片與麻仁丸可能均摻入土大黃。

2.2 HPLC法

2.2.1 溶液的制備

供試品溶液的制備：取四黃瀉火片10片，除去包衣，稱定重量，研細，混勻，（或取麻仁丸適量，剪碎），精密稱取0.5 g，置錐形瓶中。加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用甲醇補充減失重量，混勻，濾過用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

圖1 四黃瀉火片與麻仁丸片的TLC圖

對照品溶液制備：精密稱取對照品8 mg于100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

陰性樣品溶液的制備：精密稱取陰性樣品粉末0.5 g,照供試品溶液的制備項下的方法制備。

參照樣品溶液的制備：精密稱取對參照樣品粉末0.5 g，照供試品溶液的制備項下的方法制備。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：資生堂 CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水(18∶82)為流動相，檢測波長 324 nm，流速為1.0 ml/min，進樣量：10 μl，柱溫：35℃，理論板數(shù)土大黃苷峰計算應不低于3 000[1]。土大黃苷峰與各雜質(zhì)峰分離度均應大于2。自動進樣。

2.2.3 結(jié)果

分別取對照品溶液、供試品溶液，陰性樣品溶液，參照樣品溶液各10 μl進樣測定。結(jié)果表明：供試品溶液中主峰保留時間與土大黃苷對照品溶液的色譜峰保留時間一致，通過DAD檢測進一步檢測，主峰與土大黃苷峰的DAD（紫外光譜圖）一致且雜質(zhì)不干擾樣品測定，而參照樣品溶液在土大黃苷對照品主峰相應保留時間未出現(xiàn)色譜峰。對照品溶液、供試品溶液色譜圖見圖2，DAD光譜圖見圖3。

2.2.4 方法學

2.2.4.1 精密度試驗色譜條件：精密吸取土大黃苷對照品溶液10 μl，連續(xù)進樣7次，記錄對照品色譜峰保留時間，分別為12.585、12.563、12.546、12.523、12.489、12.496、12.501 min，RSD為0.3%，結(jié)果表明，進樣精密度良好。

2.2.4.2 最低檢出限的測定：精密吸取土大黃苷對照品溶液，并釋釋至刻度，搖勻，精密吸取1 ml，置100 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。照上述色譜條件，進樣5 μl，記錄色譜圖，結(jié)果信噪比為S/N為13∶1時，最低檢出限為 4×10-3μg，信噪比為S/N為3∶1時，最低檢出限為0.916×10-3μg。

3 討論

為了測定土大黃苷的含量，流動相采用甲醇-乙腈-水溶液（用磷酸調(diào)節(jié) pH3.5）（35∶5、60），乙腈-0．1%磷酸溶液（加入0．1%三乙胺）（20∶80），乙腈-水（18∶82），經(jīng)過試驗，采用乙腈-水（18∶82）檢出的色譜峰最理想，土大黃苷色譜峰能達基線分離。理論板數(shù)為16 000。供試品土大黃苷色譜峰與其他質(zhì)譜分離度大于2.0。故選此系統(tǒng)作為流動相進行實驗。

圖2 HPLC色譜圖

供試品的提取溶劑及方法的考察，分別采用乙酸乙酯、乙腈、甲醇作為溶劑的考察，結(jié)果以甲醇為提取溶劑提取30 min效果最好。

測定波長的選擇：在高效液相色譜條件下，利用二極管陳列檢測器對土大黃苷對照品在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果土大黃苷在219 nm、324 nm波長處均有最大吸收，其中324 nm響應植最高且波長適中，確定324 nm為檢測波長。

判斷標準：薄層；供試品色譜中，在供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，不得顯相同顏色的熒光斑點。若出現(xiàn)相同顏色的熒光斑點，則用下列高效液相色譜法驗證。在液相色譜圖中，應不得出現(xiàn)與對照品色譜保留時間相同的色譜峰。若出現(xiàn)可以判斷為不合格。

實驗結(jié)果表明，本方法采用TLC結(jié)合HPLC法相結(jié)合檢測手段，用于篩查和檢測四黃瀉火片、麻仁丸是否摻入土大黃，保證人民用藥安全。

[1]國家藥典委員會.中國藥典2005年版[M].一部北京:化學工業(yè)出版社,2005:384.

[2]國家藥品監(jiān)督管理局.中成藥地方標準上升國家標準部分內(nèi)科脾胃分冊[S].WS-10940（ZD-0940）-2002.

[3]王啟硯.HPLC法測定麻仁丸中大黃素和大黃酚的含量[J].中國藥師,2006,9(7):622-623.

[4]盧兗偉.金錢草與土大黃有效成分研究與應用[D].北京:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院,2003.

[5]馬錦星.補充檢驗方法和項目是打擊藥品摻雜、摻假行為的有效手段[J].中國藥事,2004,18(3):158.

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[7]劉艷,張勤.婦炎康膠囊中非法添加化學藥品的快速檢測[J].中國藥師,2010,13(6):887-888.

Establishment of a method of determining Rhaponitin in Sihuang Xiehuo tablets and Maren pill

LI Xia
(Pharmaceutical preparation section,the Second People's Hospital of Xiangtan,Hunan Province,Xiangtan 411100,China)

Obiective:To establish a method for the identification of rhaponitin in Sihuang Xiehuo tablets and Maren pill.Methods:Both the HPLC and TCL were employed to identify..ResultsThe method of TLC combimed with HPLC had good stability and repeatability.Conclusion:The method is convenient,fast and selective,can identify the Rhaponitin in Sihuang Xiehuo tablets and Maren pill effectively.

Sihuang Xiehuo tablets;Maren pill;Rhaponitin;TLC;HPLC

R943.1

B

1674-4721（2010）12（a）-052-02

2010-10-14）