董紅霞,劉 卅,郭建維(廣東工業(yè)大學輕工化工學院,廣東廣州,50006;2華南理工大學生物醫(yī)學工程研究院,廣東廣州,5064;3廣東省高性能與功能高分子材料重點實驗室,廣東廣州,5064)

樹枝狀聚賴氨酸的合成

董紅霞1,劉 卅2,3,郭建維1
(1廣東工業(yè)大學輕工化工學院,廣東廣州,510006;2華南理工大學生物醫(yī)學工程研究院,廣東廣州,510641;3廣東省高性能與功能高分子材料重點實驗室,廣東廣州,510641)

合成了一種具有精確分子結構的樹枝狀聚賴氨酸,并用1H-NMR&13C-NMR和ESI-M S和MALD I-TOFM S等手段對所得產(chǎn)物結構進行了表征。通過不同條件實驗的方法對樹枝狀聚賴氨酸的合成條件進行了優(yōu)化。結果表明,反應溫度、切割時間和溶劑對產(chǎn)率的影響明顯。優(yōu)化后的反應條件是原料配比為NDi-Boc-賴氨酸:N己二胺=2∶1.0;冰水浴下反應2小時后溫度升高至25℃繼續(xù)反應24小時;保護基團切割時間為1.5小時。在優(yōu)化的條件下,產(chǎn)物最高收率為80.2%。采用DM F作溶劑,效果優(yōu)于DCM。

樹枝狀;合成;優(yōu)化;表征

樹枝狀聚氨基酸的合成不僅具有很重要的理論意義,而且具有重要的應用價值。樹枝狀大分子是通過逐步合成的方法向核外增加多價層,樹枝狀大分子的物理尺寸變化范圍很大,通常典型的是介于小分子和乳化粒子之間。樹枝狀大分子的多樣性幾乎是無限的,核的結構和層數(shù)、末端官能團[1]都可以變化使該類聚合物的分子尺寸、分子量、表面節(jié)點、分子對稱性和親水性具有多樣性,所有這些性能對化學和藥學性能都有影響。因此在各種工程領域的潛在用途變得相當廣泛[2]。樹枝狀聚氨基酸的生物應用已經(jīng)引起了廣泛的關注,例如,多分支抗原肽的發(fā)展,作為制備磁共振成像[3]、造影劑的支架以及用作基因載體,因此在生物化學、分子生物學及化學生物學等領域具有廣闊的應用前景。本實驗研究了一種樹枝狀聚賴氨酸的合成方法,并對樹枝狀聚賴氨酸的合成條件進行了優(yōu)化。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

Boc-L-Lys(Boc)-OH·DCHA:HPLC級,吉爾生化上海有限公司;1-羥基苯丙三氮唑(HOBT): HPLC級,吉爾生化上海有限公司;三氟乙酸(TFA):HPLC級,吉爾生化上海有限公司;苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)∶HPLC級,吉爾生化上海有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DM F)、三乙胺、無水乙醚、無水乙醇、二氯甲烷(DCM)、檸檬酸等試劑均為分析純,市售。

1.2 合成路線

圖1 樹枝狀聚賴氨酸的合成路線圖Fig.1 Synthetic scheme for the p reparation of the Poly-L-lysine dendrimers

1.3 D i-Boc-樹枝狀聚賴氨酸的合成方法[4]

D i-Boc-樹枝狀聚賴氨酸是以己二胺作核在均相條件下逐步反應生成的。將Boc-L-Lys(Boc)-OH·DCHA、HOBT和HBTU在50℃真空干燥3h,干燥好后在50m l的三口瓶中按設定配比(質(zhì)量比,下同)依次加入Boc-L-Lys(Boc)-OH· DCHA、三乙胺、HBTU和HOBT,最后加入己二胺,采用DM F或DCM作為溶劑。溫度控制在0℃-35℃,通入氮氣開始反應。反應結束后將制得的D i-Boc-樹枝狀聚賴氨酸進行減壓蒸餾,以除去溶劑。再用過量10%的檸檬酸水溶液使其沉淀,過濾并用大量蒸餾水洗滌,得白色固體,最后用少量的乙醇將其溶解,并加入15倍的乙醚進行萃取,萃取三次后,真空干燥稱重得第一代D i-Boc-樹枝狀聚賴氨酸。

1.4 保護基的切割方法

將上述干燥好的第一代D i-Boc-樹枝狀聚賴氨酸粗產(chǎn)品加入圓底燒瓶,開始通入氮氣,并加入適量三氟乙酸(TFA)開始攪拌,室溫下反應設定的時間。反應結束后,加入大量無水乙醚,離心收集沉淀為第一代產(chǎn)物。

第二代和第三代的合成方法與第一代一樣,分別用已合成的第一代和第二代繼續(xù)反應獲得。

2 表征方法

樹枝狀聚賴氨酸的結構通過1H-NMR&13CNMR[5]、電噴霧電離源質(zhì)譜(ESI-M S)和基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MALD I-TOF M S)來表征。1H-NMR&13C-NMR譜用德國Burker公司的AVANCE D igital 400MHz NMR型波譜儀測定,TM S為內(nèi)標,溶劑采用Cam bridge Isotope Laboratories Inc的氘代核磁試劑DM SO-d6。電噴霧電離源質(zhì)譜(ESI-M S)用德國布魯克公司Esquire HCT PLUS型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀采用ESI離子源,溶劑采用ACN/H2O測定?；|(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MALD I-TOF M S)用德國B ruker公司autoflex IIIsm artbean型MALD I-TOF質(zhì)譜儀。

3 結果與討論

樹枝狀聚賴氨酸是以己二胺作為起始核通過液相多肽合成法[6]合成的產(chǎn)物。D i-Boc-樹枝狀聚賴氨酸通過在檸檬酸水溶液中沉淀從混合物種分離出來,合成過程如圖1所示。該法是用HBTU做縮合劑,加入HOBT以減少副反應并抑制消旋,加快反應速度提高產(chǎn)率[7]。為了確保完全反應,要求氨基酸和縮合劑過量。使用三乙胺目的是通過中和己二胺核的鹽酸鹽[8],這樣得到D i-Boc-樹枝狀聚賴氨酸。最后我們用三氟乙酸將粗產(chǎn)品切割得到第一代產(chǎn)物DPLYS-G1。每一代聚賴氨酸的合成都通過1H-NMR、13C-NMR、ESI-M S或MALD I-TOFM S檢測。每代產(chǎn)物都用質(zhì)譜檢測,所得分子量與理論值接近,說明產(chǎn)物純度比較高。

3.1 合成條件的選擇優(yōu)化

3.1.1 反應溫度的影響

采用DM F為反應溶劑,Boc-L-Lys(Boc)-OH· DCHA的投料量為1.0mmol(即528m g),NDi-Boc-賴氨酸∶N己二胺=2∶1.0,在冰水浴中反應兩小時后,分別升溫至25℃、35℃繼續(xù)反應24小時,反應后切割時間為1.5小時。所得產(chǎn)率分別為80.2%、60.5%。通常情況下,溫度每升高10℃,相應的反應速率也會增大約一倍,但當反應溫度從25℃升高到35℃時,產(chǎn)率反而降低,這主要是由于溫度過高,己二胺揮發(fā)較快,故采取在冰水浴下反應兩小時后升溫至25℃反應。

3.1.2 切割時間的影響

采用DM F為反應溶劑,Boc-L-Lys(Boc)-OH· DCHA的投料量為1.0mmo l(即528m g), NDi-Boc-賴氨酸∶N己二胺=2∶1.0,在冰水浴中反應兩小時后升溫至25℃繼續(xù)反應24小時,反應后切割時間分別為1.0、1.5、2.0小時。所得產(chǎn)率分別為75.2%、80.2%、72.5%。實驗發(fā)現(xiàn)在三氟乙酸作用下,經(jīng)過1.5小時,即可大部分脫除,得到淡黃色液體。在使用三氟乙酸時,當脫除時間過長,反應液變成灰色粘稠液體,加入少量CH2C l2作溶劑,可以避免灰色液體的生成。保護基Boc的切割時間不足或超過1.5小時,產(chǎn)率均降低,這是由于切割時間太短不能完全切除干凈,切割時間超過1.5小時,切割下來的Boc又與氨基結合,故切割時間為1.5小時為宜。

3.1.3 溶劑的影響

分別采用DM F和DCM為反應溶劑,Boc-L-Lys (Boc)-OH·DCHA的投料量為1.0mmol(即528m g),NDi-Boc-賴氨酸∶N己二胺=2∶1.0,在冰水浴中反應兩小時后,分別升溫至25℃繼續(xù)反應24小時,反應后切割時間為1.5小時。所得產(chǎn)率分別為80.2%、76.2%。N,N-二甲基甲酰胺(DM F)與二氯甲烷(DCM)是多肽合成中常用的溶劑,但得到的產(chǎn)率不同,主要是因為DM F對羥基與Boc氨基酸的成酯反應有抑制作用,同時DM F對作用物和產(chǎn)物均具有溶解度高的優(yōu)點而被廣泛應用于多種反應系統(tǒng)中[9]。故采用DM F作溶劑,效果優(yōu)于DCM。

3.2 樹枝狀聚賴氨酸的結構表征

從圖2可以看出G1在1.71 ppm、1.43 ppm、1.255ppm分別出現(xiàn)了賴氨酸側鏈的β、γ、δ質(zhì)子特征峰,在3.68處出現(xiàn)了與肽鍵連接的α質(zhì)子峰。在G2、G3的譜圖中,這些峰變得更寬,內(nèi)層側鏈上的β、δ質(zhì)子峰會向高場移動。這種現(xiàn)象極有可能是由于外層的賴氨酸對內(nèi)層的賴氨酸的化學屏蔽效應引起的[10]。

從G1的1H-NMR譜圖上可知3.68處出現(xiàn)了與肽鍵連接的α質(zhì)子峰,由于第二代的賴氨酸與樹枝狀分子表面有共軛作用,所以這個峰向低場的4.20ppm移動。對于G3來講,這兩個峰移向低場的4.19ppm。

圖2 DPLYS-G1的1HNMR譜圖Fig.2 1H-NMR spectra of the DPLYS-G1in DM SO-d6

從圖3、圖4分析得知:G1:ESI(m/z,[M+ H]+)∶373.3;計算值:372。G2:ESI(m/z,[M +H]+)∶885.7,計算值:884。G3:MALD I-TOF (m/z,[M+H]+)∶1910.486,計算值:1908。質(zhì)譜測定結果揭示了在縮合反應時,低代樹枝狀聚合物的表面氨基被完全取代了,每代產(chǎn)物末端氨基數(shù)量與理論值基本一致,所測分子量與理論值吻合。

圖3 DPLYS-G1的電噴霧電離源質(zhì)譜圖Fig.3 ESIm ass spectra of the DPLYS-G1

圖4 DPLYS-G3的基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜圖Fig.4 MALD I-TOFm ass spectra of the DPLYS-G3

4 結論

(1)采用液相多肽合成法合成了以己二胺為核的一至三代新型D i-Boc-樹枝狀聚賴氨酸,并用TFA去除保護基。經(jīng)1H-NMR和13C-NMR分析,產(chǎn)物峰明顯;經(jīng)質(zhì)譜鑒定,確定目標產(chǎn)物為樹枝狀聚賴氨酸。

(2)反應溫度、切割時間和溶劑對產(chǎn)率的影響明顯。

(3)優(yōu)化后的反應條件為,在冰水浴中反應兩小時后升溫至25℃繼續(xù)反應24小時,切割時間為1.5小時,用DM F作溶劑。

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Syn thesis of Po ly-L-lysine Dendr im ers

DONG Hong-xia1,L IU Sa2,3,GUO Jian-w ei1
(1 Faculty of Chem ical Engineering&L ight Industry,Guangdong University of Techno logy,Guangzhou 510006, Guangdong,China;2 B iom edical Engineering Institute,South China University of Technology,Guangzhou 510641,Guangdong,China;3 Key Laboratory of H igh Perform ance and Functional Po lym ers, Guangdong p rovince,Guangzhou 510641,Guangdong,China)

Po ly-L-lysine dend rim ersw ith p recisemo lecu lar architecturesw ere syn thesized.The structuresof the p roductsw ere further characterized by1H-NMR,13C-NMR,ESI-M S andMALD I-TOFM S.Synthetic conditionsof Po ly-L-lysine dendrim erswere op tim ized asw ell.The resu lts show ed that the yield of the p roductwasobviously influenced by three factors,such as reaction temperature,Boc-removed tim e and solvent.The op tim ized reaction conditions are:p roportion of reactant dosage:NDi-Boc-Lysine:Nhexanediamine=2∶1.0(mo l/mo l);A fter the reaction m ixturewas stirred at icywater bathing for2 hours,and kep t up at room temperature for 24 hours;Boc-removed tim e=1.5 hours.Under the op tim ized conditions,the highest yield of the p roduct is 80.2%.In addition,DM F was found to be the better so lvent than DCM.

dend rim er;synthesis;op tim ization;characterization

2010-04-20

TQ 31