李發(fā)勝，池曉峰，劉海日，趙輝，孫文平，劉茜#（.大連醫(yī)科大學化學教研室，大連市6044；.沈陽藥科大學，沈陽市 006）

鹽酸二甲雙胍（Metformin hydrochloride，MH）是臨床上常用的治療非胰島素依賴型和部分胰島素依賴型糖尿病的藥物，它主要抑制腸壁吸收葡萄糖，增加骨骼肌和周圍組織對葡萄糖的攝取和利用，增加肝細胞對葡萄糖的攝取、抑制高血糖素的釋放或抑制胰島素拮抗物的作用[1]。此外，該藥在肥胖癥[2]、非酒精性脂肪肝[3]、代謝綜合征[4]、多囊卵巢綜合征[5]等方面也有臨床應用，但對于這些作用的分子機制并不完全了解。目前對于鹽酸二甲雙胍的研究大多為有關人體的藥動學研究[6]，而對于組織分布的研究較少。本實驗旨在了解鹽酸二甲雙胍在小鼠體內的藥動學和組織分布情況，為臨床合理用藥和進一步研究其新應用的作用機制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1200系列高效液相色譜（HPLC）儀，包括泵系統(tǒng)、二極管陣列檢測器及工作站等。

1.2 試藥

鹽酸二甲雙胍片（上海施貴寶制藥有限公司，批號：0801055，規(guī)格：每片500 mg）；鹽酸二甲雙胍及內標阿替洛爾標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為、100664-200602、100117-200504，純度均為100%）；乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑為分析純；水為超純水。

1.3 動物

健康昆明系♂小鼠90只，體質量18～22 g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（遼）2008-0002。

2 方法與結果

2.1 給藥方案與樣品采集

所有小鼠均在實驗前禁食12 h，自由飲水。30只小鼠隨機分為10個時間組，每組3只。精密稱取鹽酸二甲雙胍片溶于生理鹽水，配制成8 mg·mL－1溶液，單次灌胃給藥200 mg·kg－1。于給藥前0 h和給藥后0.33、0.67、1、2、3、4、6、8、10 h各時間點經(jīng)眼球后靜脈叢取血，每個時間點約采集200 μL，置于肝素化的EP管中。離心（5 000 r·min－1）5 min，取血漿100 μL置于－20℃下保存。小鼠采血后，立即處死，在上述各時間點，迅速取出心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、肌肉置于生理鹽水中，用生理鹽水將樣品洗凈，用濾紙吸干組織表面水份后，分別稱量各臟器濕重，加4倍生理鹽水勻漿，制成組織勻漿液，－20℃冷凍保存。

2.2 色譜條件及方法專屬性考察

色譜柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：10 mmol·L－1NaH2PO4/10 mmol·L－1十二烷基硫酸鈉（pH 3.5）-甲醇（47∶53）；流速：1.0 mL·min－1。檢測波長：235 nm。

取空白血漿、空白血漿+鹽酸二甲雙胍和內標標準品、血漿樣品（服藥后0.67 h）、空白小腸組織、空白小腸組織+鹽酸二甲雙胍和內標標準品及小腸組織樣品（服藥后0.67 h）進樣測定，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatography

由圖1可見，二甲雙胍保留時間約為15.8 min，內標保留時間約為13.7 min，血漿和組織中二甲雙胍與內標、內源性物質分離良好且完全。

2.3 標準溶液制備

精密稱取鹽酸二甲雙胍標準品20 mg，置于100 mL容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻，即得200 mg·L－1的標準貯備液。精密稱取內標標準品5 mg，置于100 mL容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻，即得50 mg·L－1的標準貯備液。

2.4 樣品處理

取樣品100 μL置于離心管中，加入乙腈200 μL、內標30 μL，渦旋混合10 min，離心（10 000 r·min－1）10 min，取上清液20μL進樣。

2.5 標準曲線和定量限

以“2.1”項下給藥前0 h采集的血漿和組織為空白樣品，分別取空白血漿和組織勻漿液100μL，各加鹽酸二甲雙胍和內標標準系列溶液，制備成相當于鹽酸二甲雙胍血漿濃度為2、4、8、15、30、60、100 mg·L－1和組織濃度為5、8、15、30、60、100、120 mg·L－1的模擬生物樣品，按“2.4”項下方法操作。以鹽酸二甲雙胍濃度（X）為橫坐標，鹽酸二甲雙胍與內標峰面積比值（Y）為縱坐標，用加權（W＝1/X2）最小二乘法進行回歸運算，求其線性回歸方程。血漿和各組織樣品的線性回歸方程見表1。

表1 小鼠血漿及各組織中線性回歸方程Tab 1 Equations of linear regression in plasma and tissues of mice

經(jīng)計算得血漿中定量檢查下限為2 mg·L－1，組織勻漿液中定量檢查下限為5 mg·L－1。

2.6 回收率、精密度和穩(wěn)定性

按規(guī)定方法考察了鹽酸二甲雙胍在低、中、高濃度（5、15、80 mg·L－1）的血漿和小腸組織方法回收率和日內、日間RSD；另考察了含鹽酸二甲雙胍濃度為5、15、80 mg·L－1的血漿或組織樣品在室溫放置24 h、反復凍融2次及冰凍20 d條件下的穩(wěn)定性。結果顯示，血漿或組織樣品室溫放置24 h，RSD在0.5%～6.8%之間；反復凍融2次，RSD在2.1%～11.3%之間；冰凍20 d，RSD在1.2%～8.2%之間，說明樣品穩(wěn)定性良好。回收率與精密度結果見表2。

表2 回收率與精密度結果（n＝5）Tab 2Recovery and precision test（n＝5）

由表2可見，該結果符合生物樣品分析要求。

2.7 藥動學研究

按“2.4”項下操作，進樣分析小鼠血漿及組織樣品，計算各時間點樣品中的二甲雙胍濃度，平均濃度-時間曲線見圖2。

采用DAS 2.0軟件對數(shù)據(jù)進行擬合處理，二甲雙胍在小鼠體內的經(jīng)時過程符合口服給藥二室模型。主要藥動學參數(shù)AUC為（52.93±2.34）mg·h·L－1，CL為（0.059±0.002）L·h－1，消除相t1/2為（3.61±0.22）h，tmax為0.67 h，Cmax為（18.61±0.78）mg·L－1。

2.8 組織分布

圖2 血漿及各組織中鹽酸二甲雙胍的濃度-時間曲線Fig 2 Plasma concentration-time curves of metformin hydrochloride in plasma and tissue

小鼠灌胃給藥后，其組織濃度分布見圖2。在給藥0.67 h后，所有組織中均能測到二甲雙胍；給藥10 h后，心、肝、脾、肺中檢測不到二甲雙胍。小腸、肺、肝、肌肉、脾、腎、胃、心臟各組織中AUC分別為（952.76±66.53）、（157.38±11.11）、（282.77±5.49）、（236.35±8.64）、（101.734±0.85）、（308.773±4.94）、（294.601±6.38）、（137.542±1.83）mg·h·L－1。

3 討論

本實驗建立了分析鹽酸二甲雙胍在小鼠體內藥動學和組織分布的方法。在濃度測定時，選用乙腈為蛋白沉淀劑處理樣品，方法較為簡單；選用十二烷基硫酸鈉離子對試劑，可使二甲雙胍保留時間優(yōu)化；選擇內標阿替洛爾，峰形良好，理論塔板數(shù)高且與鹽酸二甲雙胍及血漿中其它內源性物質互不干擾，得到了較好的分離效果。因此，該方法簡單、快速、準確。

小鼠藥動學研究結果表明，二甲雙胍進入體內后吸收迅速，血中藥物濃度tmax約為0.67 h，隨后血藥濃度下降迅速。二甲雙胍在體內滯留時間較短，清除速率較快。

組織分布結果表明，給藥后二甲雙胍迅速分布，藥物主要蓄積在小腸、胃、肝、腎中，在小腸中高濃度蓄積，腎、胃和肝中也較多，肺、心及脾中較少。給藥10 h后心、肝、脾、肺中已檢測不到二甲雙胍，在體內清除也快，這與藥動學結果相符合。

二甲雙胍在小腸中的含量遠高于其它組織，說明在服藥后一段時間內胃腸道壁內會聚集較高水平的二甲雙胍，口服鹽酸二甲雙胍后主要在小腸吸收；在肝中二甲雙胍含量也較高，說明肝也是二甲雙胍作用的主要器官；在腎中的二甲雙胍含量也處于較高水平，說明腎為二甲雙胍排泄的主要器官，與文獻報道[7]相吻合。

[1]李 端.藥理學[M].第6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：358.

[2]Dastjerdi MS，Kazemi F，Najafian A，et al.An open-labelpilot study of the combination therapy of metformin and fluoxetine for weight reduction[J].Int J Obes，2007，31（4）：713.

[3]Bugianesi E，Gentilcore E，Manini R，et al.A randomized controlled trial of metformin versus vitamin E or prescriptive diet in nonalcoholic fatty liver disease[J].Am J Gastroenterol，2005，100（5）：1 082.

[4]Aguiar LG，Bahia LR，Villela N，et al.Metformin improves endothelial vascular reactivity in first degree relatives of type 2 diabetic patients with metabolic syndrome and normal glucose tolerance[J].Diabetes Care，2006，29（5）：1 083.

[5]Nawrocka J，Starczewski A.Effects of metform in treatment in women with polycystic ovary syndrome depends on insulin resistance[J].Gynecol Endocrinol，2007，23（4）：230.

[6]劉學紅，王本杰，郭瑞臣.復方鹽酸二甲雙胍片人體生物等效性研究[J].中國藥房，2005，16（1）：44.

[7]余繼英，何 林，吳正中，等.鹽酸二甲雙胍的體內過程及臨床應用[J].職業(yè)衛(wèi)生與病傷，2002，17（4）：300.