郭金耀，楊曉玲

（淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005）

鹽藻SOD純化條件研究

郭金耀，楊曉玲

（淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005）

為了便于對鹽藻SOD的研究與利用，建立一種較好的鹽藻SOD純化方法，實驗對鹽藻SOD的純化條件進行了研究。結(jié)果表明，對鹽藻SOD提取液在70℃下加熱20 min，取上清加入0.4倍-35℃丙酮沉淀SOD，沉淀溶解于適量的20 m M、pH 7.6 PBS緩沖液中上DEAE-52柱，用ddH2O+1.00 mol/L NaCI-0.02 mol/L PBS (pH 7.6)組合進行梯度洗脫，可有效地將鹽藻提取液中的SOD與雜蛋白分離，獲得近60%的SOD活力回收率，純化倍數(shù)達到413。

鹽藻；SOD；熱變性；丙酮沉淀；柱層析

Abstract:In order to research and utilize SOD in Dunaliella salina，it is necessary for us to establish the method of purification the SOD in Dunaliella salina.Experiment studied treatment conditions for Purification the SOD in Dunaliella salina.Results show that under the following conditions: the SOD crude extracts heated for 20 min at 70 ℃; the supernatant liquid added acetone of 0.4 times and -35℃ was precipitated; the precipitated SOD dissolved in the 20 mM,pH 7.6 PBS buffer and separated by DEAE-52 column chromatography; adopting a method of gradient elution SOD washed with combination ddH2O+1.00mol/L NaCI-0.02 mol/L PBS (pH 7.6)from column,the SOD in Dunaliella salina can be efficiently separated and purified from its protein.The recovery rate was about 60%,and purification multiplier was as high as 413.

Key words：Dunaliella salina; superoxide dismuta; heat treatment; acetone precipitation; column chromatography

在生物機體中，超氧化物歧化酶(SOD)是自由基的主要清除者[1]。目前 SOD已較多地應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、保健品及食品中，且隨著研究的深入，它的應(yīng)用范圍不斷擴大[2]。SOD研究和應(yīng)用的深度和廣度已居酶類生化制劑的前列[3]。目前國際市場SOD精品售價高達3萬美元/g[4]。SOD是一族含金屬的酶。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)中所含有金屬元素種類的不同，SOD分為Fe-SOD，Mn-SOD和Cu、Zn-SOD 3種不同的類型。SOD廣泛存在于動植物、真核微生物和部分原核微生物等需氧生物細胞內(nèi)[5]。對不同生物中 SOD的分離純化存在有多種多樣的方法，并已有許多報道，如陳藝虹等[6]研究了豬血 Cu、Zn-SOD的分離純化，張沙艷[7]等研究了玉米SOD的分離及純化，蘇昕等[8]研究了酵母SOD分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)等。但鹽藻 SOD的純化方法仍未見報道。由于鹽藻具有極度耐鹽性，可在飽和鹽水中生存，鹽藻SOD成為一種高鹽適應(yīng)酶[9]，且活性很高[10]，所以鹽藻 SOD具有重要的研究利用價值。本實驗對鹽藻 SOD的純化條件進行了研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

參照郭金耀等的方法[9]，將鹽藻（Dunaliella salina）培養(yǎng)至對數(shù)生長期用于實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹽藻 SOD 的提取方法 取鹽藻培養(yǎng)液4 000 r/min離心15 min，收集藻細胞溶解于適量的蒸餾水中反復(fù)凍融3次，用超聲波破碎20 min，然后以4 000 r/min離心20 min得上清，即為鹽藻SOD的粗提取液。測定酶活和蛋白含量。

1.2.2 鹽藻 SOD活性的測定方法 采用鄰苯三酚自氧化法[11]。以每毫升反應(yīng)液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達 50%的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.2.3 鹽藻蛋白質(zhì)含量的測定 參照郭金耀等[12]的方法進行。

1.2.4 加熱溫度選擇實驗 試管中加入適量鹽藻SOD粗提取液，分別在40、50、60、70、80 ℃水浴中加熱20 min，然后4 000 r/min離心20 min，上清即為SOD粗純化液。測定酶活和蛋白含量。

1.2.5 丙酮比例選擇實驗 試管中加入適量鹽藻SOD粗提取液，分別加入-35℃的丙酮0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 倍(v/v)，置4℃冰箱中緩慢攪拌2 h，然后4 000 r/min離心20 min，沉淀溶解于適量的20 m M pH 7.6 PBS緩沖液中，即為SOD粗純化液。測定酶活和蛋白含量。

1.2.6 離子交換柱層析流動相選擇實驗 實驗在美國伯樂公司生產(chǎn)的Biologic DuoFlow蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)中進行。離子交換層析流動相為4種不同的A、B雙組份洗脫液：① ddH2O+1.00mol/L NaCI-0.02 mol/L PBS (pH 7.6)；② ddH2O+1.00 mol/L NaCI-0.02 mol/L Tris (pH 7.6)；③ ddH2O+0.60 mol/L PBS (pH 7.6)；④ ddH2O+0.02 mol/L Tris(pH 7.6)。采用階式梯度洗脫方式進行沖洗。上樣前，DEAE-52柱(1.6×25 cm)用洗脫液B液充分平衡；將經(jīng)加熱和丙酮處理的樣品經(jīng)0.45 nm微孔濾膜過慮，上樣量為 3 ml。洗脫時，控制流速為1.5 ml/min,洗脫體積90 ml，并用檢測器檢測記錄A280和A260變化動態(tài)，洗脫峰手動收集，進行酶活和蛋白含量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱溫度對鹽藻SOD酶學(xué)特性的影響

分別測定不同處理溫度加熱獲得的純化液中SOD的活力及蛋白質(zhì)含量，計算SOD比活力，結(jié)果如圖1。

圖1 溫度與SOD活力及比活力的關(guān)系Fig.1 Relation between temperature and the activity and specific activity of SOD

由圖 1可見，在 40-70 ℃的溫度范圍內(nèi)加熱20 min，SOD的活力幾乎沒有變化，仍保持在較高水平。只有當(dāng)溫度升高至80 ℃時，SOD活力開始明顯下降。說明SOD能耐70 ℃以下的高溫，在這種溫度下 SOD不會變性失活。同時也可以看出，SOD的比活力隨著加熱溫度的提高呈直線上升的趨勢，到溫度升至70 ℃時，SOD的比活力升至最高。當(dāng)溫度繼續(xù)升高至80 ℃時，SOD的比活力不再增加。說明在加熱的過程中，提取液中有許多的雜蛋白類發(fā)生了變性而沉淀。隨著加熱溫度的提高，這種雜蛋白變性沉淀進一步加劇，使 SOD的比活力不斷上升，即純度逐漸增加。由此可見，對鹽藻SOD提取液在70 ℃下加熱20 min是提純SOD的一個有利條件。

2.2 丙酮加入比例對鹽藻SOD酶學(xué)特性的影響

分別測定加入不同比例丙酮處理獲得的純化液中SOD的活力及蛋白質(zhì)含量，計算SOD比活力，結(jié)果如圖2。

圖2 丙酮比例對SOD活力及比活力影響Fig.2 Influences of the ratio of acetoned on the activity and specific activity of SOD

從圖2可見，隨著加入丙酮比例的增加，SOD活力也隨之增加，丙酮比例增加至0.6時，SOD活力達到最大，繼續(xù)增加丙酮比例至1.0時，SOD活力有所下降。說明在提取液中較多的丙酮加入對SOD的活力影響較小。但同時可見，丙酮加入比例超過0.4后，繼續(xù)提高丙酮加入的比例，獲得的純化液中 SOD的比活力幾乎呈現(xiàn)直線下降趨勢。在丙酮加入比例為0.4時，SOD的比活力最高，即獲得的純化液中 SOD的純度最高。說明在丙酮加入比例為0.4時，提取液中的雜蛋白變性沉淀較少，較少一同進入SOD沉淀中，使離心獲得的SOD純度提高，純化液中 SOD的比活力增強。在丙酮加入比例增高時，提取液中的雜蛋白變性沉淀增多，會一同進入SOD沉淀中，使離心獲得的SOD純度降低，純化液中SOD的比活力減小。所以，0.4倍的丙酮加入量是SOD純化的又一個有利條件。

2.3 流動相對離子交換層析結(jié)果的影響

實驗在美國伯樂公司生產(chǎn)的Biologic DuoFlow蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)中進行。離子交換層析流動相為4種不同的A、B雙組份洗脫液，采用階式梯度洗脫方式進行沖洗。洗脫結(jié)果見表1。

表1 鹽藻SOD在DEAE-52柱中的梯度洗脫結(jié)果Tab.1 Results of gradient elution SOD by DEAE-52 column chromatography

由表1可知，洗脫劑B分別為單純的PBS或Tris的梯度洗脫，沒有洗脫峰出現(xiàn)。說明SOD不被保留，可能由于流動相中大量強陰離子與陰離子交換劑上抗衡離子緊密結(jié)合的緣故。洗脫劑B為NaCI-Tris的梯度洗脫，在洗脫進行至72.25 min時出現(xiàn)1個洗脫峰，其余時間段都沒有洗脫峰出現(xiàn)。說明SOD與雜蛋白分不開。洗脫劑B為NaCI- PBS的梯度洗脫，在洗脫進行至64.00 min和75.09 min時分別出現(xiàn)1個洗脫峰，兩峰完全分開。說明SOD得到了較好的分離。所以，鹽藻SOD在DEAE-52柱上的梯度洗脫中，最佳洗脫劑為ddH2O+1.00 mol/L NaCI-0.02 mol/L PBS (pH 7.6)組合。

2.4 鹽藻SOD的分離純化結(jié)果

對鹽藻SOD提取液在70℃下加熱20 min，取上清加入0.4倍-35℃丙酮沉淀SOD，制成SOD柱層析上樣溶液，在美國伯樂公司生產(chǎn)的Biologic DuoFlow蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)中上DEAE-52柱，用

ddH2O+1.00 mol/L NaCI-0.02 mol/L PBS (pH 7.6)組合進行梯度洗脫，測定分析每一分離純化階段中的SOD活力、蛋白質(zhì)含量和SOD比活力。實驗結(jié)果見表2。

表2 鹽藻SOD的分離純化結(jié)果Tab.2 Results of separation and purification of SOD in Dunaliella salina

由表2可見，鹽藻SOD提取液經(jīng)過熱變性、丙酮沉淀和DEAE柱層析的處理過程，SOD的總活力有一定的損失，但比活力顯著提高，活力回收率達到近60%，純化倍數(shù)提高至413。說明這一鹽藻SOD的純化過程，有效地將鹽藻提取液中的 SOD與雜蛋白分離，可形成具有較高純度的 SOD純化產(chǎn)品，為鹽藻 SOD的進一步研究與利用奠定了基礎(chǔ)——建立了一種較好的鹽藻SOD純化技術(shù)方法。

3 討論與小結(jié)

鹽藻SOD具有耐高溫的特性。對鹽藻SOD純化時，可以通過加熱使提取液中的其它蛋白發(fā)生變性沉淀而與 SOD分離。實驗中，通過 70℃加熱20 min的處理，使SOD的比活力提高了12.4倍，有效地去除了提取液中的其它蛋白質(zhì)。所以對提取液70℃加熱20 min是提純SOD非常便利而又有效的一項操作處理。

SOD與提取液中其它蛋白在丙酮中的溶解性存在較大差異，可以利用丙酮加入的不同比例來提純SOD。實驗中，對加熱處理后的SOD溶液再加入0.4倍的丙酮時，純化效果最好。這是純化SOD的第二項好的操作。

純化SOD的第三項有效操作是DEAE柱層析。這項操作需要一定的設(shè)備條件，并且不同的洗脫液洗脫會獲得不同的結(jié)果。實驗中比較了4種雙組份洗脫液的效果，結(jié)果表明 ddH2O+1.00 mol/L NaCI-0.02 mol/L PBS (pH 7.6)組合為最佳，它可使SOD比活力比提取液提高413倍。這項操作為鹽藻SOD的分子特性研究奠定了基礎(chǔ)。

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Research of treatment conditions for purification superoxide dismutase in Dunaliella salina

GUO Jin-yao,YANG Xiao-ling
(Key Construction Lab of Marine Biotechnology of Jiangsu Province,School of Marine Science and Technology,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China)

Q554; Q94921+2

A

1001-6932(2010)04-0417-04

2009-09-09；

2009-12-11

江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室開放課題項目（HS08010），淮海工學(xué)院自然科學(xué)基金（Z2007033）

郭金耀（1956－），男，教授，現(xiàn)從事海洋藻類生理學(xué)研究。電子郵箱：gjyao6688@yahoo.com.cn