王振華 楊鯤鵬 王旭廣 張進(jìn) 郝德勛 陳占軍

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%左右，肺癌的發(fā)生是多步驟、多階段、多基因相互作用的結(jié)果，涉及多種癌基因的激活與抑癌基因的失活，其中抑癌基因的失活在近幾年的研究中越來(lái)越受到重視[1]。肺癌腫瘤抑制物1（tumor suppressor in lung cancer-1, TSLC1）是Murakami[2]通過(guò)功能互補(bǔ)方法發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤抑癌基因，該基因的突變與失活與人類多種腫瘤密切相關(guān)。肺腺癌差異表達(dá)基因（differentially expressed in adenocarcinoma of the lung, 4.1B）蛋白主要定位于細(xì)胞-細(xì)胞聯(lián)結(jié)處，呈蜂窩狀分布。研究[3]表明在腦膜瘤、乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌和結(jié)腸癌等腫瘤組織中4.1B無(wú)論是RNA還是蛋白均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)或缺失現(xiàn)象。目前對(duì)上述兩種基因的研究多集中于蛋白水平，且兩者在NSCLC中表達(dá)的相關(guān)性國(guó)內(nèi)報(bào)道尚少。本研究應(yīng)用RT-PCR的方法從基因水平上檢測(cè)TSLC1、4.1B在NSCLC中的表達(dá)，并分析兩者的相關(guān)性及其與患者臨床病理特征的關(guān)系，旨在為NSCLC的臨床診斷、預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移和分子治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 所有標(biāo)本均來(lái)自2009年12月-2010年4月間鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為NSCLC的新鮮腫瘤組織52例及相應(yīng)癌旁正常組織52例。其中男性33例，女性19例；年齡35歲-73歲，平均（55.12±8.61）歲；組織分型：鱗癌29例，腺癌23例；分化程度：高分化17例，中分化23例，低分化12例；TNM分期：I期15例，II期24例，III期13例。所有病例術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療及其它針對(duì)腫瘤的生物學(xué)治療。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增 取新鮮冰凍組織約100 mg加入Trizol 1 mL（按說(shuō)明書(shū)操作）逐步提取總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算所提RNA濃度。cDNA（complementry DNA）第一鏈合成體系為20 μL，取總RNA 8 μL、EasyScriptRT/RI Enzyme Mix 1 μL、Anchored Oligo(dT)10 μL、2×ES Reaction Mix 1 μL，輕輕混勻，42oC孵育30 min，85oC加熱5 min。取2 μL進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增，其余-80oC保存?；騎SLC1、4.1B及內(nèi)參（β-actin）擴(kuò)增應(yīng)用Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），交北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板cDNA 2 μL、10×Easy Taq Buffer 5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、Easy Taq DNA Polymerase 1 μL、上、下游引物各1 μL加水至50 μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)條件：94oC預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94oC變性30 s，XoC退火30 s，72oC延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72oC總延伸6 min。最后4oC保存。

1.2.2 PCR產(chǎn)物結(jié)果判斷及半定量分析 取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，目的基因mRNA的表達(dá)量以目的基因的DNA條帶和β-actin的DNA條帶灰度值比值計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示，兩組定量資料比較采用t檢驗(yàn)，不滿足t檢驗(yàn)條件的采用t′檢驗(yàn)。多組定量資料比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。指標(biāo)間相關(guān)性用Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSLC1 mRNA與4.1B mRNA在NSCLC組織及相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá) 凝膠電泳顯示，TSLC1 mRNA（1 367 bp）條帶清晰無(wú)雜帶擴(kuò)增，目的基因片段產(chǎn)物與設(shè)計(jì)引物條帶產(chǎn)物大小吻合，癌旁正常組織中條帶亮度明顯高于癌組織（圖1A）。4.1B mRNA（145 bp）條帶清晰無(wú)雜帶擴(kuò)增，目的基因片段產(chǎn)物與設(shè)計(jì)引物條帶產(chǎn)物大小吻合，癌旁正常組織中條帶亮度明顯高于癌組織中條帶亮度（圖1B）。癌旁正常組織中TSLC1 mRNA與4.1B mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表2）。

2.2 TSLC1 mRNA與4.1B mRNA的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系 52例NSCLC組織中TSLC1 mRNA與4.1B mRNA的表達(dá)量在高、中分化組及TNM分期早期明顯高于低分化組及TNM分期晚期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與性別、年齡、組織分型無(wú)關(guān)（P＞0.05）（表3）。

表1 TSLC1、4.1B和內(nèi)參β-actin引物列表Tab 1 TSLC1、4.1B and β-actin primers list

圖1 TSLC1 mRNA（A）和4.1B mRNA（B）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖。N為癌旁正常組織；T為癌組織；M為Mark。Fig 1 Gel electrophoresis of PCR amplification products for TSLC1 mRNA (A) and 4.1B mRNA (B). N are from tumor adjacent tissues; T are from tumor tissues; M are from Mark.

表2 TSLC1 mRNA與4.1B mRNA在NSCLC組織及相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)Tab 2 The expressions of TSLC1 mRNA and 4.1B mRNA in NSCLC and corresponding adjacent normal tissue

2.3 TSLC1 mRNA與4.1B mRNA在NSCLC組織中表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示：肺癌組織中TSLC1 mRNA表達(dá)與4.1B mRNA表達(dá)之間呈正相關(guān)（r=0.471,P＜0.001）（圖2）。

圖2 TSLC1 mRNA與4.1B mRNA在癌組織中表達(dá)水平的散點(diǎn)圖Fig 2 Scatter distribution of relative expressions of TSLC1 mRNA and 4.1B mRNA

3 討論

TSLC1全長(zhǎng)大約300 kb，定位于人類染色體11q23.2上，含10個(gè)外顯子。翻譯產(chǎn)物為含有442個(gè)氨基酸殘基的跨膜糖蛋白。TSLC1屬于細(xì)胞粘附分子中免疫球蛋白超家族成員編碼細(xì)胞粘附分子（cell adhesion molecule,CAM），該分子是參與細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用的一種膜蛋白，除外周血淋巴細(xì)胞外人體絕大部分正常組織均表達(dá)TSLC1分子，它通過(guò)介導(dǎo)同種或異種細(xì)胞之間的相互粘附，在抑制惡性腫瘤的發(fā)生中起重要作用[4]。目前的研究[5-7]發(fā)現(xiàn)TSLC1的表達(dá)缺失或減少參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括乳腺癌、食管癌和宮頸癌。臨床病理學(xué)研究分析顯示TSLC1的失活在腫瘤晚期發(fā)生更頻繁。Yang等[8]用免疫組化法發(fā)現(xiàn)TSLC1的表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)受累、淋巴管滲透以及血管入侵呈負(fù)相關(guān)。因此我們推測(cè)TSLC1可能與腫瘤的生物學(xué)行為，包括侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究顯示：TSLC1的表達(dá)與NSCLC的分化程度、TNM分期有關(guān)（P＜0.05），而與患者的性別、年齡以及病理分型無(wú)關(guān)（P＞0.05），研究結(jié)果與國(guó)外現(xiàn)有文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，說(shuō)明TSLC1可能影響NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，TSLC1可以作為判斷NSCLC惡性程度的一個(gè)重要的生物學(xué)指標(biāo)。

4.1 B屬于4.1超家族蛋白，定位于人類染色體的18p11.3區(qū)域，4.1蛋白通過(guò)與肌動(dòng)蛋白、血影蛋白等家族的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞膜蛋白的胞質(zhì)區(qū)相互作用，維持細(xì)胞的正常形態(tài)和生理特性[10]。據(jù)Ohno等[11]報(bào)道4.1B在消化系統(tǒng)中可能不僅有維持其正常結(jié)構(gòu)構(gòu)建的作用而且有維持正常細(xì)胞增殖和粘附的作用，因此可抑制上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。Tran等[12]發(fā)現(xiàn)與癌旁肺組織相比，肺腺癌中4.1B mRNA表達(dá)水平明顯降低，在所檢測(cè)的10株細(xì)胞中有8株細(xì)胞4.1B mRNA表達(dá)缺失。本研究顯示：與癌旁正常組織相比，4.1B蛋白在肺腺癌和肺鱗癌中的表達(dá)明顯減少，并且還顯示4.1B表達(dá)與NSCLC分化程度、TNM分期有關(guān)（P＜0.05），而與患者的性別、年齡以及病理分型無(wú)關(guān)（P＞0.05），說(shuō)明4.1B可能影響NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步證實(shí)了4.1B是一種廣泛存在的抑癌基因。

表3 TSLC1 mRNA與4.1B mRNA的表達(dá)與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系Tab 3 The relationship between the expressions of TSLC1 mRNA and 4.1B mRNA and the clinical features

Yageta等[13]研究認(rèn)為T(mén)SLC1通過(guò)4.1B與肌動(dòng)蛋白骨架相連接，兩種基因可能位于同一級(jí)聯(lián)路徑維持穩(wěn)定的粘附結(jié)構(gòu)。癌細(xì)胞中TSLC1或4.1B的缺失可能影響正常細(xì)胞粘附，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移到鄰近組織或末梢組織。TSLC1-4.1B級(jí)聯(lián)反應(yīng)也影響原發(fā)性腦脊膜瘤的發(fā)生發(fā)展[14]，這些都說(shuō)明TSLC1和4.1B之間存在密切聯(lián)系，我們用RT-PCR的方法研究了NSCLC中兩種基因的表達(dá)及其相互關(guān)系，結(jié)果表明TSLC1與4.1B在NSCLC組織中的表達(dá)量明顯低于相應(yīng)癌旁正常肺組織（P＜0.01），TSLC1與4.1B在癌組織的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.471, P＜0.001）。

總之，TSLC1與4.1B在NSCLC組織表達(dá)下調(diào)或缺失均與NSCLC的分化程度及TNM分期有關(guān)，與患者的性別、年齡以及病理分型無(wú)關(guān)，并且二者具有相關(guān)性。TSLC1蛋白可能與4.1B蛋白共同參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。但我們目前僅是對(duì)其基因水平的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，要想確定其作為抑癌基因的功能還需要對(duì)上述兩種基因是否具有生長(zhǎng)抑制的功能及其作用的信號(hào)通路進(jìn)行更深入的研究，從而進(jìn)一步闡明TSLC1與4.1B在NSCLC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，也將為NSCLC發(fā)病機(jī)制的研究提供新的依據(jù)，為NSCLC的臨床診斷提供新的標(biāo)志物，并有可能為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。