李 紅，丁曉雯，*，石 晶，王海燕

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400716；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400716）

蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)研究

李 紅1，2，丁曉雯1，2，*，石 晶1，2，王海燕1，2

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400716；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400716）

目的：研究蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)。方法：蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：用方差分析（t檢驗(yàn)）比較各致突變物微核率與對(duì)照組微核率的差異顯著性，提出當(dāng)微核指數(shù)大于1.5時(shí)，可以判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，即該物質(zhì)確有致突變性。

蠶豆根尖微核，致突變，微核指數(shù)

Abstract：Aim：To study the judgment criterion of positive result in Vicia faba root tips micronucleus test.Methods：Micronucleus test of Vicia faba root tip cells.Conclusions：The analysis of variance（t test）was used to compare the significance of difference between the micro-nucleus rate that measured by these mutagens and the control group，proposing if the micro-nuclear index more than 1.5，then it can be judged the result was the positive result，that is to say，the material did lead to mutation.

Key words：micronucleus of Vicia faba root tips；mutagenicity；micro-nuclear index

蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)是全球公認(rèn)的環(huán)境致突變性檢測(cè)技術(shù)［1］，也是我國環(huán)境生物測(cè)試的規(guī)范方法［2］，目前該實(shí)驗(yàn)技術(shù)也用于食品遺傳作用的評(píng)價(jià)［3-5］。蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)作為環(huán)境致突變性檢測(cè)技術(shù)有其他檢測(cè)手段無法比擬的很多優(yōu)點(diǎn)，水質(zhì)遺傳毒性檢測(cè)中污染指數(shù)的引入，很好地避免了因?qū)嶒?yàn)條件等因素帶來的本底微核率的波動(dòng)，把微核率與污染程度聯(lián)系起來，可以直觀地根據(jù)污染指數(shù)（Pollution index，PI）鑒定所測(cè)水樣的污染程度［6］，準(zhǔn)確而快速。但是污染指數(shù)只適用于水質(zhì)污染程度的判斷。現(xiàn)在利用蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食品致突變物仍是根據(jù)樣本組和陰性對(duì)照組的微核千分率差異是否具有顯著性來判斷，不方便而且準(zhǔn)確性不夠好。所以需要探索建立一個(gè)比較合適的、定量的陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)。在食品致突變物的檢測(cè)中能否像水環(huán)境中污染指數(shù)一樣也引入一個(gè)指數(shù)，通過這個(gè)指數(shù)不僅可以避免因?qū)嶒?yàn)條件等因素而產(chǎn)生的誤差，而且能準(zhǔn)確而快速地判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。微核指數(shù)就是在這種思路下提出并探索用于食品中致突變物的判定。環(huán)磷酰胺是公認(rèn)的蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本［3，7］，重鉻酸鉀、疊氮鈉、硝酸鉛也都有致突變性［8-9］，能誘發(fā)蠶豆根尖產(chǎn)生微核，所以本實(shí)驗(yàn)用環(huán)磷酰胺、重鉻酸鉀、疊氮鈉、硝酸鉛四個(gè)陽性樣本進(jìn)行蠶豆根尖實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶豆 購于北碚農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；環(huán)磷酰胺 山西普德藥業(yè)有限公司；疊氮鈉（化學(xué)純） 浙江城關(guān)化工廠；重鉻酸鉀 分析純，重慶北碚化學(xué)試劑廠；硝酸鉛 分析純，重慶吉元化學(xué)有限公司；堿性品紅 分析純，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；卡諾氏固定液 無水乙醇∶冰醋酸=3∶1，自制；本實(shí)驗(yàn)所用其它試劑 均為分析純；水 均為蒸餾水。

顯微鏡 XSN-3G顯微鏡，重慶光電儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［10］。用致突變物環(huán)磷酰胺、疊氮鈉（NaN3）、重鉻酸鉀（K2Cr2O7）、硝酸鉛（Pb（NO3）2）分別配成不同的濃度梯度，對(duì)發(fā)芽種子7粒蠶豆根尖進(jìn)行侵染處理。每個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)樣本吸取20mL于培養(yǎng)皿中，再將發(fā)芽蠶豆的根尖放入，使樣本液浸泡住根尖5h。然后恢復(fù)培養(yǎng)、固定和染色。每組取5條根尖制片，在40倍鏡下分別觀察1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)微核細(xì)胞數(shù)。每次實(shí)驗(yàn)以蒸餾水作陰性對(duì)照，求出微核率和微核指數(shù)，計(jì)算公式如下：

表1 各種陽性致突變物誘導(dǎo)蠶豆根尖微核率與微核指數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 微核的識(shí)別

微核形態(tài)為圓形、橢圓形和不規(guī)則形的，并與主核分離的小核。微核在嗜色性、折光性、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、邊緣光整、所處平面、厚度等方面與主核一致，其直徑為主核直徑的1/20～1/3。詳見圖1～圖4，箭頭所指為微核。

圖1 蠶豆根尖微核40倍顯微鏡下攝片（a）

2.2 不同樣本對(duì)蠶豆根尖微核率的影響

各種陽性致突變物的微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。從表1可以看出，用蒸餾水作陰性對(duì)照的微核率為8.74‰，符合生物監(jiān)測(cè)規(guī)范上提出的本底微核率不超過 10‰ 的要求［2］。

圖2 蠶豆根尖微核40倍顯微鏡下攝片（b）

圖3 蠶豆根尖微核100倍油鏡下攝片（a）

圖4 蠶豆根尖微核100倍油鏡下攝片（b）

從表1可以看出，環(huán)磷酰胺的致突變性，0.1、1、10、20、50!g/mL的環(huán)磷酰胺的微核率均明顯高于陰性對(duì)照的微核率。經(jīng)t檢驗(yàn)，其P值均小于0.01，能誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞微核率的顯著提高。表1表明，環(huán)磷酰胺在0.1～10!g/mL的范圍內(nèi)與蠶豆根尖微核有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，但20!g/mL以后微核率降低。研究表明，蠶豆根尖細(xì)胞也存在應(yīng)激性，常溫下在接觸低劑量的誘變因子后，會(huì)對(duì)更高劑量的誘變因子產(chǎn)生適應(yīng)性，從而減弱誘變劑對(duì)細(xì)胞的損傷［11］。所以，環(huán)磷酰胺濃度過大可能使蠶豆根尖產(chǎn)生了適應(yīng)性，反而會(huì)抑制微核的產(chǎn)生。但可以肯定，環(huán)磷酰胺在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞有致突變的誘導(dǎo)效應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)確定0.1～50!g/mL的濃度范圍內(nèi)的重鉻酸鉀、疊氮鈉和0.1～100!g/mL濃度范圍內(nèi)硝酸鉛都在蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)中都有一定的致突變性，所以通過本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了其陽性致突變性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中當(dāng)重鉻酸鉀濃度為0.1!g/mL時(shí)微核指數(shù)為1.37，差異不顯著，硝酸鉛濃度為0.1!g/mL時(shí)微核指數(shù)為1.38，差異顯著，可以初步提出微核指數(shù)大于1.38時(shí)，該化學(xué)物質(zhì)就有致突變性，結(jié)果為陽性。但是，綜合比較其他實(shí)驗(yàn)計(jì)算出的微核指數(shù)［3-5，8，12］，我們可以謹(jǐn)慎地提出蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)當(dāng)微核指數(shù)大于1.5時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果即為陽性。本研究中也驗(yàn)證了此結(jié)果，微核指數(shù)在此之上，差異均為極顯著，微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性。

3 結(jié)論

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，提出用蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)測(cè)定食品或其他環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)的致突變性，當(dāng)微核指數(shù)大于1.5時(shí)，可以判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，即該物質(zhì)確有致突變性。

［1］GrantW F.Higherplantassaysforthe detection of chromosomal aberrations and gene mutations-a brief historical background on their use for screening and monitoring environmental chemicals［J］.Mutat Res，1999，426：107-112.

［2］國家環(huán)境保護(hù)局.環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范（水環(huán)境）部分［M］.中國環(huán)境科學(xué)出版社，1986：75-78.

［3］陳宏偉，朱蘊(yùn)蘭，洪國錦.蟲草多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)微核的抑制作用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（6）：9-11.

［4］范雪濤，馬丹煒，劉爽，等.蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)在辣子草化感作用研究中的應(yīng)用［J］.生態(tài)環(huán)境，2008，17（1）：323-326.

［5］桂明英，郭永紅，朱萍，等.美味牛肝菌致突變作用研究［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2008，15（2）：42-46.

［6］陳光榮，金波，李明，等.污染指數(shù)在微核技術(shù)監(jiān)測(cè)水質(zhì)污染中的應(yīng)用［J］.中國環(huán)境科學(xué)，1986，6（2）：60-63.

［7］莊昉成，楊寅楣.環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞微核率的劑量-效應(yīng)關(guān)系［J］.重慶環(huán)境科學(xué)，1990，12（4）：56-57.

［8］劉燦輝，蔡煥興.蠶豆根尖微核技術(shù)監(jiān)測(cè)環(huán)境致突變物的研究［J］.四川環(huán)境，1995，14（3）：40-41.

［9］高雪，胡婧，金毅.EDTA對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘變作用［J］.氨基酸和生物資源，2004，26（1）：35-37.

［10］孔志明.環(huán)境毒理學(xué)［M］.第二版.南京大學(xué)出版社，2004：175-178.

［11］Rieger R，Michaelis A，Takehisa S.Low temperature between conditioning and challenge treatmentpreventsthe adaptive response of Vicia-faba root-tip meristem cells［J］.Murat Res，1992，282（2）：69-72.

［12］季守蓮，鈕榮祥，宋正蕊.蠶豆根尖微核技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)毒物的致突變性［J］.中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2003，30（5）：68.

Study on judgment criterion of positive result in Vicia Faba root tips micronucleus test

LI Hong1，2，DING Xiao-wen1，2，*，SHI Jing1，2，WANG Hai-yan1，2
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.Laboratory of Agricultural Product Processing Technique in Chongqing，Chongqing 400716，China）

TS201.1

A

1002-0306（2010）10-0229-03

2009-09-03 *通訊聯(lián)系人

李紅（1985-），女，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全。