孫軍濤,王洪新,呂文平,馬朝陽,戴易興

(江南大學食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫,214122)

1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因克隆表達及其耐熱性研究進展＊

孫軍濤,王洪新,呂文平,馬朝陽,戴易興

(江南大學食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫,214122)

1,3-1,4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73)是一類降解β-葡聚糖中與β-1,3糖苷鍵相鄰的β-1,4糖苷鍵的酶,因其主要分解大麥中的1,3-1,4-β-葡聚糖和細菌地衣多糖(又稱地衣多糖酶),廣泛應用于發(fā)酵和飼料工業(yè)。但其高溫條件下酶活較低,構建高溫下活性高的1,3-1,4-β-葡聚糖酶成為近年來研究的熱點。文中介紹了1,3-1,4-β-葡聚糖酶的生化特性,綜述了1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因的克隆表達、耐熱性及其應用方面的研究進展,并對其研究前景進行了展望。

1,3-1,4-β-葡聚糖酶,基因克隆,基因表達,耐熱性

1,3-1,4-β-葡聚糖是禾本科高等植物(谷物類)細胞壁的多糖組分,是由1200個以上的β-D-葡萄糖殘基通過β-1,3和β-1,4糖苷鍵連接而成的線性分子,在大麥、燕麥、高粱、大米和小麥等谷物胚乳細胞壁中的含量尤為豐富,不同谷物β-葡聚糖中2種糖苷鍵鍵型的比例和寡糖單元的長度有所不同,如大麥,90%以上的水溶性β-葡聚糖是由單一的β-1,3糖苷鍵連接纖維三糖和纖維四糖所組成;谷物中1,3-1,4-β-葡聚糖在萌發(fā)初期主要被其內源性葡萄糖水解酶所降解,其中活性最強的內源性葡聚糖水解酶是1,3-1,4-β-葡聚糖酶(1,3-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase,1,3-1,4-glucanase,E.C.3.2.1.73,簡稱β-葡聚糖酶或地衣多糖酶),它是只降解β-葡聚糖中與β-1,3糖苷鍵相鄰的β-1,4糖苷鍵的酶,其降解產物主要是纖維三糖和纖維四糖(見圖1)[1]。

圖11,3-1,4-β-葡聚糖酶催化水解大麥β-葡聚糖反應

不僅植物中能夠產生β-葡聚糖酶,許多微生物(細菌和真菌)也能分泌β-葡聚糖酶,這2類酶在氨基酸序列和三維空間結構上雖無同源性,但具有相同底物的專一性。植物產β-葡聚糖酶屬于糖水解酶家族17,其三級結構呈(a/β)8折疊桶;而微生物產β-葡聚糖酶屬于糖水解酶家族16,其三級結構呈果凍狀β-三明治結構[2]。

β-葡聚糖在啤酒生產和飼料加工過程中會產生一些問題,如降低麥芽汁和啤酒過濾速度,影響啤酒風味,在啤酒儲存過程中易引起沉淀[3];過多的β-葡聚糖會增加飼料的黏性和不可消化性,降低飼料的營養(yǎng)價值。在生產加工過程中,由于高溫處理,使谷物內源性的1,3-1,4-β-葡聚糖酶失活,在啤酒生產和飼料加工過程中,添加適量的耐熱的活性高的1,3-1,4-β-葡聚糖酶能夠解決工業(yè)生產中由β-葡聚糖引起的負面影響。

本文主要對微生物產生的1,3-1,4-β-葡聚糖酶的生化特性,酶基因的克隆,表達和耐熱性以及其在工業(yè)中的應用進行了綜述,旨在為研究高活性耐熱1,3-1,4-β-葡聚糖酶提供參考。

1 酶的生化特性

芽孢桿菌β-葡聚糖酶是由1條蛋白多肽鏈折疊而成,其分子質量在25～30 ku,等電點(p I)為7.5～9.1,最適pH接近中性,為6～7.5[除短芽胞桿菌(B.brevis),最適pH為9,嗜堿芽孢桿菌N137(A lkalophilic B acillussp.N137)在pH7～12內仍有大于80%酶活外]。酶的最適反應溫度分別為45℃[多黏芽孢桿菌(B.polym yxa)[4]],55℃[枯草芽孢桿菌(B.subtilis)[5],解淀粉芽孢桿菌(B.am yloliquefaciens)[5],地衣芽孢桿菌(B.lichenifor m is)[6])和 65℃(浸 麻 芽 孢 桿 菌(B.m acerans)[5]]。酶的比活力在 1200～4500 μmol/(min·mg)之間(以水解大麥β-葡聚糖轉化為還原糖葡萄糖的量計算),以大麥和地衣多糖為底物時的Km值分別在1.2～1.5 mg/mL和0.8～2.0 mg/mL之間。

雖非芽孢桿菌的1,3-1,4-β-葡聚糖酶與芽孢桿菌相比多出了其他功能的結構域,但是他們有相似的生物化學特性,幾種非芽胞桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶的分子量大小,最適pH值,最適溫度如表1所示。

表1 非芽胞桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶的酶學特性

2 1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因克隆

許多芽孢桿菌屬來源的1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因已經克隆并進行了測序,主要包括B.subtilis[11],B.am yloliquefaciens[12],B.m acerans[13],B.circulans[14]等,除了環(huán)狀芽孢桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶外,已經克隆的芽孢桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因在核苷酸和氨基酸酸序列上都有同源性,環(huán)狀芽孢桿菌酶的分子質量約為其它芽孢桿菌酶的2倍,并能降解纖維素。嗜堿芽孢桿菌N137的酶在C-末端有富含賴氨酸區(qū)域,而在其他的β-葡聚糖酶中沒有發(fā)現(xiàn)這樣的區(qū)域。

1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因也在非芽孢桿菌屬中克隆,它們的催化活性區(qū)域序列與芽孢桿菌酶的同源性很高,但常常也有其他功能結構域。從瘤胃球菌(Rum inococcus flavofaciens)克隆了雙功能xynD基因,該基因是既有木聚糖酶結構域(N-末端),又有1,3-1,4-β-葡聚糖酶結構域(C-末端),兩結構域通過含309個氨基酸殘基的結構域相連,該結構域中有功能未知由30個氨基酸殘基組成的富含Thr氨基酸的序列,與芽孢桿菌β-葡聚糖酶相比,該酶對海帶多糖呈現(xiàn)一定的專一性,但是對地衣多糖或谷物葡聚糖的活力較低[15]。

已經確定真菌有產生1,3-1,4-β-葡聚糖酶的基因,Chen等首次從厭氧真菌O rpinom yces中克隆出1,3-1,4-β-葡聚糖酶的基因,其氨基酸殘基序列與細菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶序列同源性高,并且不含有大多數真菌水解酶具有的非催化結構域[9]。

3 1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因表達

細菌產1,3-1,4-β-葡聚糖酶已經在許多不同宿主菌中表達,如大腸桿菌(Escherichia coli)、芽孢桿菌(Bacillusstrains)、啤酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)以及其他轉基因植物大麥和煙草中。

在大腸桿菌中表達1,3-1,4-β-葡聚糖酶是采用芽孢桿菌自身的啟動子和信號肽序列或采用大腸桿菌的啟動子,根據目的基因和宿主菌的不同而不同,所表達的1,3-1,4-β-葡聚糖酶不僅能夠積累在周質空間內,也能夠分泌在細胞外(細胞外占20%～60%,細胞質周圍占60%～20%),有10%～50%的酶仍保留在細胞內。Goldenkova[16]等通過修飾細菌產1,3-1,4-β-葡聚糖酶的基因(licBM2)建立一種新的報告基因系統(tǒng),研究基因在原核生物(大腸桿菌)和真核生物(釀酒酵母)中表達的機理,結果表明表達產物具有很好的活性。呂文平[17]等在克隆載體上亞克隆了短小芽孢桿菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因全長,用BamHI和XhoⅠ雙酶切目的片段構建重組表達載體pET-pum,導入大腸桿菌BL21中成功表達了β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因。

芽孢桿菌作為宿主菌進行1,3-1,4-β-葡聚糖酶表達時,表達的水平取決于質粒的拷貝數和菌株的種類[18],釀造和飼料工業(yè)上用的1,3-1,4-β-葡聚糖酶主要是由枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的高產菌株獲得。通過去除相關的基因序列,已經構建出一系列基因缺失的β-葡聚糖酶,纖維素酶,木糖酶芽孢桿菌菌株。

酵母菌作為宿主菌,將芽孢桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因進行異源表達,構建雜合釀酒酵母,用于降解麥芽中的β-葡聚糖。在酵母中表達的N-末端糖基化的1,3-1,4-β-葡聚糖酶與在大腸桿菌中表達的非糖基化酶相比有更好的熱穩(wěn)定性,糖基化的形式取決菌株種類和培養(yǎng)條件[19]。通過對地衣芽孢桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因優(yōu)化,該密碼子的96個氨基酸進行優(yōu)化,其中102個核苷酸發(fā)生變化,使(G+C)比例從43.6%上升到45.5%,并在Pichia pastoris表達,表達水平是未優(yōu)化的10倍多,重組酶的最適pH和溫度分別為6.0和45℃[20]。Huang等[21]也通過對來自琥珀酸絲狀桿菌的1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因進行優(yōu)化,并在Pichia pastoris表達,獲得了較好的表達水平。

轉基因植物也被用作宿主進行耐熱細菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因表達。來自解淀粉芽孢桿菌和浸麻芽孢桿菌的雜合葡聚糖酶基因已經被克隆,并在大麥中表達[22];用嗜熱纖梭菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶作為表達基因,分析其在轉基因煙草中表達的同源性[23]。

4 耐熱性研究

在1,3-1,4-β-葡聚糖酶耐熱性研究中也有通過酶固定化,添加保護劑或金屬離子等物理方法提高酶的耐熱性。本文主要從分子生物學角度,如構建雜合基因工程菌,定點誘變,基因缺失等方面綜述耐熱1,3-1,4-β-葡聚糖酶的研究概況。

為了獲得工業(yè)生產pH條件下具有較高熱穩(wěn)定性的酶,將不同來源的芽孢桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因進行雜合,獲的適合工業(yè)生產需要的雜合酶。浸麻芽孢桿菌是在中性條件下是熱穩(wěn)定性最好的桿菌之一,最適酶催化溫度為65℃,在75℃下仍能保持80%的酶活,但在酸性條件下活性低;而解淀粉芽孢桿菌的活性受酸性影響少,最適pH為6.0,根據二者的各自優(yōu)點,已經成功構建出一系列雜合酶[5]。

Pons等[24]研究了地衣芽孢桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶與底物結合的表面環(huán)上(從Asp51到Arg64)丙氨酸的突變與酶熱穩(wěn)定的關系,表明酶去折疊時的能量與其在65℃時的半失活時間呈正相關;其中一個突變酶(N57A)的熱穩(wěn)定性高于野生酶,說明處于表面環(huán)可及面積較高區(qū)域Asn57氨基側鏈在高溫下不穩(wěn)定。

通過對琥珀酸絲狀桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶不同位點氨基酸與催化活性的關系研究,為研究其耐熱性奠定一定的基礎。Chen等[25]對琥珀酸絲狀桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶活性位點Met39,Glu56,Asp58,Glu60,Gly63氨基酸殘基定點突變,用酶催化動力學,熒光色譜和空間結構模型分析研究酶催化活性和空間結構穩(wěn)定性的變化。與野生型酶相比,突變酶E56D,E60D,D58N和D58E的反應速率常數(kcat)分別下降了240,540,570和880倍,但具有相似底物的親和性;相反,突變酶E56A,E56Q,D58A,E60A和E60Q沒有檢測到酶活,與野生型酶和其他突變酶相比G63A突變酶顯示較低的熱穩(wěn)定性。表明Glu56,Asp58和Glu60殘基在琥珀酸絲狀桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶催化活性上發(fā)揮重要作用。Cheng等[26]也通過對琥珀酸絲狀桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶Trp54,Trp105,Trp112 Trp141,Trp148,Trp165,Trp186,Trp198和Trp203九個色氨酸殘基定點誘變,研究其對酶催化活性的影響。結果表明,Trp54,Trp141,Trp148和Trp203氨基酸殘基在維持酶結構完整性和催化活性方面發(fā)揮重要作用。為了提高琥珀酸絲狀桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶的催化活性和耐熱性,擴大其在工業(yè)中的應用,Wen等[27]研究了琥珀酸絲狀桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶C-末端與酶結構和功能的關系,利用PCR獲得了去除C-末端部分基因片段(分子質量為10 ku左右),并將其在Escherichia coliBL21或Pichia pastorisX-33宿主中表達,結果表明去除琥珀酸絲狀桿菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶C-末端部分氨基酸序列,包括絲氨酸重復片段和末端結構域中富含正電荷的序列,能夠顯著增強酶的催化活性和耐熱性。

Fu[28]等利用Clostridium ther m ocellum ZJL41,3-1,4-β-葡聚糖酶(CG)N-末端部分片段(除了信號肽序列)被Bacillus subtilis A31,3-1,4-β-葡聚糖酶(BG)相對應的片段所替代,構建了高產酶的基因片段mHG(669bp),設計了一系列的定點誘變的信號肽。由人工合成疏水信號肽H1控制的mHG從細胞質進入培養(yǎng)基中,培養(yǎng)22 h后酶活達到80.56 U/mL,通過對來自Bacillus subtilis(pBSG-H1)的mHG(25.3 ku)純化,其酶催化最適溫度為70℃,pH為5.0,在90℃下保溫10 min,仍保留83.45%的酶活,具有很好的耐熱性,有利于酶在工業(yè)生產中的應用。

李衛(wèi)芬[29]通過基因缺失、基因突變、構建雜合基因等方法系統(tǒng)地研究熱纖維梭菌β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性機制,結果發(fā)現(xiàn)熱纖維梭菌β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性與C-末端尾巴無關,與其催化結構域有關;熱纖梭菌β-葡聚糖酶催化結構域N-末端和C-末端氨基酸殘基都會影響酶熱穩(wěn)定性,這些氨基酸殘基對酶熱穩(wěn)定性的提高具有累加作用,第10～216位氨基酸殘基的存在對酶熱穩(wěn)定性的維持必不可少;蛋白質表面氨基酸的靜電作用力是影響熱纖梭菌β-葡聚糖酶催化結構域熱穩(wěn)定性的主要作用力,其中193E和169E是決定熱纖維梭菌β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的關鍵氨基酸。

5 1,3-1,4-β-葡聚糖酶在工業(yè)中的應用

5.1 在發(fā)酵工業(yè)中的應用

β-葡聚糖酶廣泛應用于發(fā)酵工業(yè),中國、美國、日本、丹麥、德國、澳大利亞等國均已采用β-葡聚糖酶作為啤酒工業(yè)的主要酶制劑。在啤酒釀造過程中,大麥胚乳細胞中的β-葡聚糖不能充分降解,β-葡聚糖的殘留是造成啤酒酒體混濁、泡沫持久力減少和掛杯力不強的主要原因,β-葡聚糖酶可以專一分解黏度很高的各種大麥β-葡聚糖,提高原料的利用率,使麥芽汁黏度降低,大大縮短麥芽汁和啤酒的過濾時間,增加啤酒產量,改善啤酒的質量。

5.2 在飼料工業(yè)中的應用

大麥是我國主要的谷物之一,產量僅次于小麥、稻谷和玉米,隨著飼料生產規(guī)?；?、現(xiàn)代化,谷物飼料尤其是大麥飼料的用量不斷增加,但其成分中的β-葡聚糖這一抗營養(yǎng)因子的存在嚴重制約了飼料的利用率。將β-葡聚糖酶作為飼料添加劑,能夠消除β-葡聚糖的抗營養(yǎng)作用,提高飼料的利用率。

5.3 在制糖工業(yè)中的應用

在制糖工業(yè)中,腸膜明串珠菌感染壓榨的蔗糖汁后,產生高黏度的葡聚糖,導致堵塞壓榨機和管道,給濃縮、結晶帶來困難,使蔗糖大量損失。添加殺菌劑不但增加成本,而且容易造成蔗糖的污染。通過添加β-葡聚糖酶來處理煎汁中的葡萄糖,減少了糖分的損失,并能取得較好的效果。

6 展望

1,3-1,4-β-葡聚糖酶是重要的工業(yè)用酶,可有效降解谷物中β-葡聚糖,減少在釀造和飼料工業(yè)中產生的負面影響,現(xiàn)代高溫的糖化工藝,對酶的熱穩(wěn)定性提出了更高的要求,并且飼料造粒的溫度也常常使酶活性損失。開發(fā)適應工業(yè)加工需要的耐熱、高活性的1,3-1,4-β-葡聚糖酶將成為發(fā)酵和飼料行業(yè)的研究熱點之一。從自然界中篩選出產1,3-1,4-β-葡聚糖酶菌株,并通過誘變等手段來提高其催化活性和耐熱性,是一種較為普遍的改善酶學特性的方法,但此方法有很大的隨機性,效果不太顯著;隨著分子生物學技術的發(fā)展,1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因已經被克隆,并在不同的載體中得到很好的表達,因此,可以通過對1,3-1,4-β-葡聚糖酶耐熱和催化機理的研究,采用定點突變或構建雜合基因的方法來提高1,3-1,4-β-葡聚糖酶催化活性和耐熱性將是一個很好的途徑。

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ABSTRACT1,3-1,4-β-glucanases(E.C.3.2.1.73)exhibits a strict substrate specificity for degradation ofβ-1,4 glycosidic bonds in 3-O-substituted glucopyranose units such as cerealβ-glucans and lichenan,which have been widely used in fermentation and feed industry.But its enzyme activity is low under high temperature,it has been a research hotspot to build a 1,3-1,4-β-glucanase with high activity under high temperature.This paper describes the biochemical characteristics of 1,3-1,4-β-glucanase and reviews its gene cloning,expression,ther mostability and application research,the research prospects of 1,3-1,4-β-glucanase are also forecasted.

Key words1,3-1,4-β-glucanases,gene cloning,expression,ther mostability,application

Development on 1,3-1,4-β-glucanases Gene Clon ing,Expression and Thermostability

Sun Jun-tao,Wang Hong-xin,LvWen-ping,Ma Chao-yang,Dai Yi-xing
(State Key Laboratory of Food Science and Technology,School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

博士研究生(呂文平副教授為通訊作者)。

＊國家自然科學基金項目(20090964);無錫市科技創(chuàng)業(yè)計劃項目(CIE00920)

2010-01-05,改回日期:2010-03-02