孫 穎,劉 泳,王華磊,陳吉祥,楊官品

(中國海洋大學海洋生命學院,山東青島266003)

弧菌16S rRNA基因特異引物設計及海洋弧菌菌群結構分析

孫 穎,劉 泳,王華磊,陳吉祥,楊官品＊＊

(中國海洋大學海洋生命學院,山東青島266003)

弧菌是海水中最常見的細菌類群之一。弧菌屬的一些種是致病菌,能引起海洋生物弧菌病,給養(yǎng)殖業(yè)造成損失。根據(jù)已有弧菌16S核糖體RNA基因(16S rDNA)序列,設計了3條弧菌屬特異引物VF169、VR744和VR1150,與細菌16S rDNA通用引物VF27一起,組成VF169/VR744、VF169/VR1150和VF27/VR744 3引物對。從海水中直接提取浮游生物總DNA,用VF169/VR744,VF169/VR1150和VF169/VR744(巢式)以及VF27/VR744引物分別擴增弧菌16S rDNA片段并克隆,分別構建了弧菌16S rDNA片段變異類型文庫。從各文庫中分別隨機選取一定數(shù)量的克隆測序,共獲得72條序列。系統(tǒng)學分析表明所有72個序列都與已知的弧菌屬細菌的序列聚類,具有很高的相似性,證明所設計的引物能用于海水樣品弧菌菌群分析。另外,VF27/VR744既具有對海洋弧菌的高度特異性,也具有恰當?shù)暮Ｑ蠡【采w面,是1對選擇擴增海水中弧菌16S rDNA的較理想引物。從獲得序列的分布情況看,膠州灣存在較高的弧菌多樣性,其中,類燦爛弧菌菌群(Vibrio splendidus-related group)是優(yōu)勢類群。

弧菌;16S rRNA基因;弧菌屬特異引物;弧菌菌群結構

弧菌是一類直的或略為彎曲的革蘭氏陰性菌,極生單鞭毛或多鞭毛,可運動?；【鷮賹儆诨【? Bergey氏細菌系統(tǒng)學手冊第二版(2005)中收錄的弧菌已達63種?；【鷱V泛分布于近岸海水、河口、海產品及海洋生物體表和腸道中。正常情況下,大多數(shù)弧菌屬于海水、動物體表和腸道的正常菌群。但當外界環(huán)境惡化時,Vibrio anguillarum,V.cholera,V.parahaemolyticus,V.vulnif icus,V.harveyi,V.ordalii和V.damsela等可引起海水魚類、甲殼類和貝類等的弧菌病。目前,弧菌病已成為魚類、對蝦等海水經濟動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要病害之一,造成巨大經濟損失[1-3]。英國健康保護署(Health Protection Agency)已公布V.parahaemolyticus,V.cholerae,V.alginolyticus, V.f urnissi,V.carchariae,V.metschnikovii,V. cincinnatiensis,V.mimicus,V.f luvialis和V. vulnif icus等10種弧菌可引起人類腹瀉、菌血癥以及嚴重外傷感染。在全球范圍內,至今已有過7次霍亂大流行,導致上千萬人死亡[4],其病原菌就是霍亂弧菌(V.cholerae)。另據(jù)報道,創(chuàng)傷弧菌V.vulnif icus可迅速致死,致死率高達60%[5-6]。因此,監(jiān)測水產品生產、加工和消費鏈中的弧菌菌群動態(tài)變化對養(yǎng)殖安全和食品安全都具有極其重要的意義[7]。

傳統(tǒng)的細菌研究都以分離的純培養(yǎng)菌株為基礎,結合一系列形態(tài)學、生理生化反應特征以及免疫學特性進行鑒定。但是,絕大多數(shù)微生物不能在現(xiàn)有人工培養(yǎng)條件下存活。人工培養(yǎng)基可能人為引入選擇壓。原核生物表型特征分析很大程度上依賴研究者經驗。因此,基于純培養(yǎng)的方法具有一定的局限性。自1977年Woese和Fox[8]用16S核糖體RNA基因序列分析細菌菌群結構以來,多種分子生物學技術被用于細菌研究,如分子雜交、PCR、SSCP、DGGE、TGGE、PFGE、RAPD、RFLP、PNA以及寡核苷酸芯片等。

PCR技術作為1種快速、高效、敏感的檢測手段,已被用于檢測V.vulnif icus[9]和V.cholerae[10]。這種檢測手段的前提是將代表細菌的目標基因片段從復雜的環(huán)境或臨床樣品中特異性富集并根據(jù)不同菌種序列的特異性予以鑒別。到目前為止,已設計出多套不同菌群的特異引物,但尚未有弧菌屬特異引物的發(fā)表。本研究旨在描述海洋環(huán)境中弧菌菌群結構,同時為弧菌高通量檢測技術建立標記基因片段的富集方法。我們設計了1套弧菌特異的PCR引物,從海水樣品DNA中擴增弧菌16S rDNA片段。經過數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析和實際海水樣品應用結果比較,最終確定了1對弧菌屬特異性和屬內覆蓋面都比較理想的引物,用于環(huán)境樣品弧菌菌群結構分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

于2003年10月分別用無菌取樣瓶取膠州灣各生態(tài)觀測站位(35°38′N～36°18′N,120°04′E～120°23′E)[11]表層海水1 L并混合,當天(從取第一個站位的水樣到實驗室過濾完海水約需要15 h)帶回實驗室,進行水樣過濾,收集浮游生物樣品。DNA提取在當天進行或者將收集的樣品-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計 設計弧菌屬特異引物要兼顧特異性和覆蓋面2個方面。海水中,細菌種類復雜多樣, PCR體系比較容易被污染。同時,16S rDNA序列比較保守,細菌種間變異小。因此,設計特定細菌類群特異性高、覆蓋面寬的引物是檢測、鑒定特定細菌類群、分析其菌群結構、多樣性及其與環(huán)境因子相關的基礎。在Olsen等[12]原核生物系統(tǒng)樹中,γ-變形菌綱是海洋中復雜度最高、豐度最大的細菌類群。絕大多數(shù)已分離鑒定的海洋細菌都屬于這一類群,如交替單胞菌屬(A lteromonas)、海洋螺菌屬(Oceanospirillum)和海桿菌屬(Marinobacter)等。腸桿菌科(Enterobacteriaceae)與弧菌科(Vibrionaceae)系統(tǒng)進化關系較近?；【浦饕êＫ写罅看嬖诘幕【鷮?Vibrio)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、格瑞蒙特菌屬(Grimontia)、腸道弧菌屬(Enterovibrio)和鹽弧菌屬(S alinivibrio)細菌。同時,巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)也是水環(huán)境中常見的菌群。

據(jù)此,從GenBank下載全部弧菌16S rDNA序列(截至2004年3月),在覆蓋盡可能多的弧菌種和已知致病弧菌的前提下,選取了118個全長或近全長序列(不少于1300 bp);同時下載了Photobacterium, Pseudoalteromonas,Proteobacterium,S almonella, Escherichia,Yersinia等與弧菌屬系統(tǒng)關系較近的序列,用DAMBE(version 1.19,http:∥aixl.uottawa. ca/)進行多序列對位分析,根據(jù)弧菌屬序列的保守區(qū)篩選其不同于其它菌群的變異位點設計引物,用Primer 5分析引物特征,再用BLAST分析檢驗其特異性。

本文篩選到VF169(5’-GGA TAA CC/TA TTG GAA ACG ATG-3’),VR744(5’-CAT CTG A GT GTC AGT G/ATC TG-3’)和VR1150(5’-TCA CCG GCA GTC TCC CTG-3’)3條弧菌屬特異引物,與細菌通用引物VF27(5’-A GA GTT TGA TCC/A TGG CTC A G-3’)一起,組成VF169/VR744、VF169/ VR1150和VF27/VR744 3引物對,用于分析海洋弧菌菌群結構。引物中V表示弧菌,F,正方向引物,R,反方向引物,引物后面的數(shù)字是各引物5’起點在大腸桿菌16S rRNA基因核苷酸序列上的位置。

1.2.2 DNA的提取 用0.22μm混合纖維素膜過濾混合海水樣品約15 L,富集海洋浮游生物,根據(jù)Polen-Fuller[13]描述的方法抽提DNA,酚、氯仿抽提純化。提取緩沖液組成為100 mmol/L Tris-HCl,p H= 8.0;1.4 mol/L NaCl;20 mmol/L EDTA,p H8.0; 2%(質量濃度)CTAB;0.1%(質量濃度)PVPP。

1.2.3 PCR擴增 用VF169/VR744,VF169/VR1150和VF169/VR744(巢式)以及VF27/VR744 3引物組合分別進行PCR擴增,以確定特異性最優(yōu)和屬內復雜性最大的組合。以VF169和VR1150為外側引物對,進行巢式PCR第一輪擴增。反應體系體積為25μL,包含20～25 ng模板DNA,2 mmol/L Mg2+,dNTP各0.2 mmol/L,正反向引物各0.2μmol/L,1單位TaqDNA聚合酶和1倍緩沖液。循環(huán)條件為95℃預變性4 min,94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min 30個循環(huán),最后在72℃延伸10 min。以VF169和VR744作為內側引物對,將第一輪擴增產物稀釋100倍,取1μL進行第二輪擴增。除以1μL第一輪產物代替DNA模板。將退火溫度下調至53℃,反應體系及擴增循環(huán)條件與第一輪基本相同。用VF169/ VR744引物對以及VF27/VR744引物對的擴增條件與巢式PCR第二輪相同。

1.2.4 PCR擴增片段克隆、測序 PCR擴增片段經苯酚、氯仿純化,連接到pMD18-T載體上,轉化感受態(tài)E.coliJM109,隨機挑選重組子進行測序。針對3種引物組合,分別選取29、33和10個克隆進行測序。這些序列在GenBank中的提取號為AY729028、AY729029、AY702244-AY702274、Y848846-AY848855。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 用Chromas軟件(version 1.62,測序服務商提供)從測序峰譜圖中提取序列并剪除引物區(qū),用DAMBE軟件包進行多序列對位分析(Multiple alignment)拼接序列,對所得序列進行BLAST分析,初步確定其分類歸屬。在此基礎上,利用MEGA軟件包(version 3.0)按照gamma分布模型,以Jukes-Cantor法計算序列相對遺傳距離和序列相似性;以neighbor-joining法構建系統(tǒng)樹,重復1000次計算bootstrap值。

2 結果

2.1 巢式PCR擴增結果

結果表明(見圖1),測序得到的29個序列全部與已知的弧菌聚類。同時,與γ-變形菌綱的其它菌屬相距較遠。將這29個序列分別進行BLAST(數(shù)據(jù)未提供)分析,所有序列的最相似序列均為弧菌屬已鑒定種。其中,21個序列與已知種的相似性在99%以上,7個序列與已知種相似性在98%以上,V TP25與V. mytili的相似性為93.8%。表明用3個特異引物進行巢式PCR,可以將弧菌屬與其它菌群區(qū)分開,使弧菌得到選擇性擴增。

2.2 VF169/VR744引物對的擴增結果

結果表明(見圖2),用VF169/VR744進行PCR擴增,得到的33個序列全部與已知弧菌聚類,并與其他菌群明顯分開。BLAST分析表明,33個序列的最相似序列均為弧菌屬成員,除VDP57與Vibriosp._ strain Mel 13的相似性為95.2%,VDP59與Vibrio chagasii相似性為97.1%,VDP65與Vibrio f ortis相似性為95%外,其余30個序列與已知種的相似性均在98%以上,表明該引物對具有較好的弧菌屬特異性。

圖1 基于巢式PCR擴增16S rRNA基因測序所得序列及γ-變形菌綱中常見類群代表序列,以Neighbour-Joining法構建的系統(tǒng)樹。以β-變形細菌為外組群,重復1 000次計算bootstrap值。其中,VTP表示本研究中經巢式PCR擴增得到的序列Fig.1 Phylogenetic tree based on partial sequences obtained by means of nested PCR,showing affiliation of 16S gene clones recovered from the surface water of Jiaozhou Bay.Sequence ofβProteobacteriawas used as outgroup.VTP series sequences indicated sequences obtained in this study.This tree was constructed by the N-J method and the bootstrap values were obtained with 1000 resamplings

圖2 基于VF169/VR744引物對擴增16S rRNA基因測序所得序列及γ-變形菌綱中常見類群代表序列構建的系統(tǒng)樹。以β-變形細菌為外組群,重復1 000次計算bootstrap值。其中,VDP表示本研究中VF169/VR744擴增得到的序列Fig.2 Phylogenetic tree based on approximately 576 nucleotide positions amplified with VF169/VR744 primer pair,showing affiliation of 16S gene clones recovered from the surface water of Jiaozhou Bay.Sequence ofβProteobacteriawas used as outgroup.VDP series sequences indicated sequences amplified with the primer pair of VF169/VR744.This tree was constructed by the N-J method and the bootstrap values were obtained with 1000 resamplings

2.3 VF27/VR744引物對擴增結果

如圖3所示,以細菌通用引物VF27和文中設計的弧菌屬特異引物VR744進行PCR擴增,測得的10個序列均與已知弧菌聚類,BLAST分析表明,其中9個序列的最相似序列為弧菌種類,相似性從97.2%到99.9%不等,只有V GP6與1株未鑒定的海洋細菌(AJ002567)最相似,但不能排除其為弧菌的可能性。因此,VR744對弧菌屬有很高的特異性,同時,細菌通用引物VF27可保證該引物對能最大限度的覆蓋弧菌屬?？梢源_定,VF27/VR744引物對是3對引物組合中最佳的弧菌屬特異引物。

2.4 膠州灣表層海水弧菌菌群結構初步分析

根據(jù)3個引物組合獲得的序列,用MEGA軟件包分別構建系統(tǒng)樹,初步分析了各取樣點覆蓋區(qū)域表層海水弧菌菌群結構(見圖1～3)。結果表明,與類燦爛弧菌群(V.splendidus-related group)相似性最高的弧菌是秋季膠州灣海域優(yōu)勢菌群,其在3組測序結果中分別占到48.3%(14/29),48.5%(16/32)和50%(5/ 10);同時,除優(yōu)勢群外,測得的序列在3株系統(tǒng)樹中分布較均勻。因此,從序列(代表不同的物種)覆蓋面上看,膠州灣海域弧菌多樣性較豐富,且秋季弧菌復雜度較高。雖然可以將序列轉換成操作分類單元(Operational taxonomic unit,OTU),計算多樣性指數(shù),但沒有標準界定種內變異程度,只能根據(jù)序列分布初步比較多樣性情況。

圖3 基于VF27/VR744引物對擴增16S rRNA基因測序所得序列及γ-變形菌綱中常見類群代表序列構建的系統(tǒng)樹。以β-變形細菌為外組群,重復1000次計算bootstrap值。其中,VGP表示本研究中VF27/VR744擴增得到的序列Fig.3 Phylogenetic tree based on approximately 725 nucleotide positions amplified with VF27/VR744 primer pair,showing affiliation of 16S gene clones recovered from the surface water of Jiaozhou Bay.Sequence ofβProteobacteriawas used as outgroup.VGP series sequences indicated sequences amplified directly by VF27 and VR744 in this study.This tree was constructed by the N-J method and the bootstrap values were obtained with 1000 resamplings

3 討論

3.1 16S rDNA在細菌分類中的應用

從1970年代開始,分子生物學方法開始用于生物進化研究,16S rDNA序列成為研究細菌系統(tǒng)發(fā)生關系的1個重要標記。1994年,Olsen和Woese首次根據(jù)16S rDNA基因的差異將原核生物劃分成12個大的類群。近年來,16S rDNA逐步在微生物的分類鑒定中發(fā)揮作用,然而,分子分類和傳統(tǒng)分類之間存在一定的差異[14]。

盡管國際細菌系統(tǒng)學委員會及新版的“Bergey氏細菌鑒定手冊”都以16S rDNA基因作為細菌分類的輔助依據(jù),一直以來并未形成一個公認的通用標準,一般傾向于將16S rRNA序列相似性達到97%以上確定為同一個種[15-16]。然而,弧菌屬不適用這一標準。Kim等已經證明16S rRNA序列在弧菌種間相似性非常高,作為區(qū)分弧菌種的依據(jù)不恰當[17-18]。本研究中,作者從GenBank隨機選取了10個>1.3kb的V. splendidus和V.lentus序列,計算得到V.lentus種內的平均遺傳距離為0.002,而V.lentus和V.splendidus種間最小遺傳距離只有0.001,說明弧菌屬中種內變異有可能大于種間變異。這與Kim的結論一致。另外,本研究構建的系統(tǒng)樹中弧菌屬內有些節(jié)點bootstrap值很低,作者認為這可能是由于弧菌屬16S rRNA序列的變異以近似連續(xù)的形式存在,種間差異不顯著,導致在進行以序列信息為依據(jù)的系統(tǒng)學分析時許多種的弧菌不具有唯一的聚類特征。鑒于以上原因,本研究未能確定一個相似性標準將所測序列劃分成可操作分類元,只根據(jù)系統(tǒng)樹對膠州灣海域弧菌菌群結構進行了初步分析。

3.2 不同引物組合的比較

將設計的引物序列分別在GenBank中做BLAST分析,結果顯示(見表1),與VF169完全匹配的全部序列中弧菌序列占73.6%(480/652),與VR744完全匹配的序列中弧菌序列占88.3%(483/547),與VR1150完全匹配的序列中弧菌序列僅占59.8%(404/676),其中,又以VR744對應的弧菌序列絕對數(shù)量最大(483個);同時,表中有部分完全匹配序列γ-變形菌綱的未鑒定種,這一部分序列也很可能是弧菌屬成員,因此, VR744的弧菌屬特異性可達到90%左右。BLAST分析提示,從遺傳學角度看,弧菌屬的主要背景干擾來自γ-變形菌綱內部,該結果與前人的結論一致。因此,文中設計引物時重點考慮排除來自該菌群內部的干擾。PCR過程中,引物-模版在3’端的3～5個堿基是否嚴謹配對對DNA能否正常延伸起著至關重要的作用[19-20]。根據(jù)這一認識,作者盡可能的把引物的選擇位點放在引物的3’端(見圖4)。VF169可以排除發(fā)光桿菌、腸桿菌和假交替單胞菌,VR1150可以將除發(fā)光桿菌外的絕大部分干擾菌排除,而VR744自身可通過3～9個堿基的差異排除個別發(fā)光桿菌(GenBank中435個發(fā)光桿菌序列只有10個與VR744完全匹配)外的所有干擾菌排除。因此,本文設計的引物序列中, VR744具有最佳的弧菌特異性。

表1 GenBank中與所設計的引物完全匹配的序列所代表的原核生物分類階元及其豐度Table 1 Abundances of the taxa represented by 16S ribosomal RNA gene sequences that perfectly match the primers designed in this study

表2 與引物序列完全匹配的已鑒定的弧菌種類(來自GenBank)Table 2 Well-identified species of genusvibriowith their 16S rDNAs available in GenBank which have identical matches with designed primers

續(xù)表1

圖4 本研究中設計的引物與γ-變形菌綱常見菌16S rRNA基因對應片段的對位分析(Multiple alignments)Fig.4 Alignments of primers and their corresponding regions in the 16S ribosomal RNA genes ofvibrioand its close genera.The specificities of primers forvibriowere determined by the mismatches at different nucleotide sites,especially at 3’termini

為了檢驗引物覆蓋弧菌屬的程度,作者于2004年7月統(tǒng)計GenBank中已分離鑒定并根據(jù)雙名法正式命名的弧菌序列66種以及原來歸入弧菌屬近年來重新歸類命名的鰻利斯頓氏菌(L istonella anguillarum)、海利斯頓氏菌(L istonella pelagia)和美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damsela)[21-22]共69種細菌。將3個特異引物分別在GenBank做BLAST分析,結果顯示(見表2),在不考慮菌株間變異的前提下,VF161可以覆蓋58種弧菌(84.1%),VR744可以覆蓋63種(91.3%),VR1150可覆蓋64種(92.8%)。同時,除Vibrio rotif erianus外,VR744可以覆蓋VF161的覆蓋范圍。說明VR744可以較全面的覆蓋弧菌屬成員。

以上分析表明,VR744具有最佳弧菌屬特異性和屬內最大的覆蓋范圍。因此,正向引物應該選擇不具有任何選擇性的細菌通用引物,即VF27。綜上所述,實驗結果和數(shù)據(jù)分析都充分證明,VF27/VR744引物對對海洋環(huán)境中的弧菌菌群表現(xiàn)出很高的特異性,同時較廣地覆蓋了該環(huán)境中弧菌的種類。它為從食品、環(huán)境樣品以及臨床樣品中迅速檢定是否污染弧菌提供了1種快捷的手段,對于海洋環(huán)境監(jiān)測,水產養(yǎng)殖中病害預測和監(jiān)控有明顯的研究意義和應用價值。

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Abstract: Vibriois among the most prevalent microbial groups in marine environment.The pathogenic species of genusVibriocausevibriosis in marine animals and should have to be responsible for severe economic losses in aquaculture worldwide every year.According to the sequences ofVibrio16S rRNA gene (16S rDNA)retrieved from GenBank,we designed threeVibrio-specific primers,VF169,VR744 and VR1150.From these designed primers and VF27(one of the universal primers of eubacteria),three pairs of PCR primers(VF169/VR744,VF169/VR1150 and VF27/VR744)were arranged.SeawaterVibrio16S rDNAs were amplified using VF169/VR744,VF169/VR1150 and VF169/VR744 in nested manner and VF27/VR744,respectively,and clone libraries were constructed accordingly.An amount of clones selected randomly from three libraries were sequenced,and 33,29 and 10 sequences were obtained from these three libraries,respectively.Phylogenetically,all of the sequences show their highest similarities to and cluster with those of diverse knownVibriospecies.Primer pair VF27/VR744 was proven to be fairly specific toVibrio-genus and could cover most species of the genus.This primer pair is useful for the analysis ofVibriocommunity structure with surface seawater samples.We can also infer from the sequences obtained thatVibrioshow marked diversity,andV.splendidusrelated group predominate in Jiaozhou Bay surface seawater in autumn.The method and data obtained in this study make it possible to develop new rapid techniques for detectingVibriospecies specifically.

Key words: Vibrio;16S rRNA gene(rDNA);Vibrio-specific primer;Vibriocommunity structure

責任編輯 于 衛(wèi)

Designing of Vibrio 16S rDNA Specific Primers and Analysis of Seawater Vibrio Community Structure

SUN Ying,LIU Yong,WANG Hua-Lei,CHEN Ji-Xiang,YANG Guan-Pin
(College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Q939.1;Q178.53

A

1672-5174(2010)09Ⅱ-122-09

國際自然科學基金(瑞典)課題(A/3224-1)資助

2009-02-25;

2010-01-15

孫 穎(1982-),碩士生。E-mail:oucsy@hotmail.com

E-mail:yguanpin@ouc.edu.cn