何 釗，馮 穎*，徐瓏峰，孫 龍，石 雷，陳曉鳴，張忠和

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國(guó)家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

云南種植瑪咖乙醇提取物的體外抗氧化活性分析

何 釗，馮 穎*，徐瓏峰，孫 龍，石 雷，陳曉鳴，張忠和

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國(guó)家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

采用鐵離子還原能力(FRAP)、Fenton反應(yīng)體系、DPPH法及鄰苯三酚自氧化體系評(píng)價(jià)種植于云南的瑪咖乙醇提取物體外抗氧化能力。結(jié)果表明：在云南種植的3種顏色瑪咖乙醇提取物均表現(xiàn)出抗氧化活性，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，但在4種抗氧化體系中的結(jié)果有所不同；紫色瑪咖的總還原能力最強(qiáng)，黃色次之，白色最弱，3200m海拔地區(qū)種植的瑪咖高于其他相對(duì)低海拔地區(qū)的瑪咖；紫色和黃色瑪咖的清除DPPH自由基能力高于白色，3200m海拔地區(qū)種植的瑪咖高于其他相對(duì)低海拔地區(qū)的瑪咖；3種顏色瑪咖對(duì)羥自由基的清除能力明顯，各樣品的清除率在加入量為200μL時(shí)均達(dá)到90%以上，3000m海拔地區(qū)種植的黃色瑪咖最強(qiáng)；3種顏色瑪咖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)均較弱。

瑪咖；顏色；抗氧化；自由基

Abstract ：The total antioxidant activity (TAC) of ethanol extracts of different color types (white, yellow and purple) of maca(Lepidium meyenii Walpers) cultivated at different altitude areas (2000, 2500, 3000 m and 3200 m) in Yunnan was measured by ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay. Also, their scavenging activities against hydroxyl free radicals generated from Fenton reaction, DPPH free radicals and superoxide anion free radicals by a pyrogallol autooxidation system were evaluated. The results indicated that ethanol extracts of 3 color types of maca cultivated in Yunnan all had dose-dependent total antioxidant and free radical scavenging effects. Purple maca presented the highest TAC, followed by yellow and white macas. The DPPH free radical scavenging activity of white maca was lower than those of other two color types of maca. A higher TAC and a higher DPPH free radical scavenging activity were both observed in maca cultivated at 3200 m-altitude area than that from lower altitude areas. Three color types of maca were all able to remarkably scavenge hydroxyl radicals, with a scavenging ratio of more than 90% at a dose of 200 μL and yellow maca cultivated at 3000 m-altitude area had the best hydroxyl free radical scavenging activity. Three color types of maca all had only weak scavenging effect on superoxide anion free radicals.

Kew words：maca (Lepidium meyenii Walpers)；color type；antioxidation；free radicals

瑪咖(Lepidium meyenii Walpers)是原產(chǎn)于秘魯海拔3500m以上安第斯高寒山區(qū)的草本植物，屬十字花科獨(dú)行菜屬[1]?，斂У脑耘嗪褪秤脷v史悠久，在南美地區(qū)，當(dāng)?shù)厝酥饕獙⑵渥鳛槭澄?，也作為傳統(tǒng)藥物使用，具有抗疲勞、改善性功能、提高生育力等多種功效[2]。近年來，瑪咖的獨(dú)特功效引起了研究者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)瑪咖除含有多種營(yíng)養(yǎng)成分外[3]，還含有瑪咖酰胺、瑪咖烯、芥子油苷及其衍生物、固醇等多種活性物質(zhì)[2-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)研究表明，瑪咖具有抗疲勞[6-7]、改善性功能[8-11]、減少前列腺增生[12]、提高生育能力[13]等多種功效，且無毒、食用安全[14]。Sandoval等[15]用ONOO－、DPPH自由基、H2O2以及去氧核糖降解的抑制作用來評(píng)價(jià)瑪咖的水提液抗氧化作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瑪咖具有清除自由基的能力以及保護(hù)細(xì)胞DNA、對(duì)抗氧化壓力的功效，作者推測(cè)可能是瑪咖水提物中芥子油苷及其分解產(chǎn)生的異硫氰酸酯類物質(zhì)發(fā)揮作用；此外，通過比較瑪咖正己烷提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物及甲醇提取物對(duì)DPPH自由基清除作用[16]，發(fā)現(xiàn)只有甲醇提取物可以明顯抑制DPPH自由基，表現(xiàn)出抗氧化活性，因此認(rèn)為瑪咖中的極性成分具有抗氧化作用。

對(duì)栽培于云南的瑪咖進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析表明，引種瑪咖與秘魯產(chǎn)瑪咖在營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)上類似[17]。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)云南引種栽培瑪咖的乙醇提物進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，以期為云南栽培瑪咖的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據(jù)表皮顏色，分別采集種植于云南省烏蒙山區(qū)4個(gè)不同海拔地區(qū)(2000、2500、3000、3200m)的白色、黃色及紫色3個(gè)類型的瑪咖塊根，自然曬干后每種隨機(jī)取樣1kg，粉碎后過60目篩，4℃冷藏備用。

二苯代苦味肼基(DPPH)、三吡啶三吖嗪(tripyridyltriazine，TPTZ) Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DU800紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)貝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 瑪咖乙醇提取液的制備

稱取各粉碎后的瑪咖樣品20g，加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇200mL，室溫下超聲提取30min，過濾后濾渣再加200mL 75%乙醇提取，共提取3次，合并濾液后減壓濃縮，75%乙醇定容到100mL，0.45μm濾膜過濾后備用。

1.3.2 瑪咖乙醇提取物總還原能力測(cè)定

采用鐵離子總還原/抗氧化方法(FRAP法)[18]。FRAP試劑：10mmol/L的TPTZ(用40mmol/L 鹽酸溶解)、20mmol/L的FeCl3·6H2O和pH3.6的乙酸緩沖液以1:1:10的體積比混勻，在37℃保溫備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取0.1mL不同濃度的FeSO4溶液，各加入3.9mL FRAP試劑，混勻后37℃反應(yīng)10min，測(cè)定593nm波長(zhǎng)處吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定：0.1mL樣品中加入3.9mL FRAP試劑，混勻后37℃反應(yīng)10min，593nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以去離子水作為空白對(duì)照，樣品還原能力以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的濃度表示。

1.3.3 瑪咖乙醇提取物清除DPPH自由基能力測(cè)定

0.4 mmol/L DPPH自由基乙醇溶液3.9mL與不同體積(10～80μL)的樣品混和，75%乙醇補(bǔ)充至4.0mL，充分混和后在暗處靜置30min，517nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

式中：Ai為樣品與DPPH自由基反應(yīng)后體系的吸光度；Aj為樣品本身吸光度(以3.9mL乙醇替代DPPH自由基)；A0為未加樣品空白值(以0.1mL 75%乙醇替代樣品)的吸光度[15]。根據(jù)清除率與加入樣品體積的關(guān)系，計(jì)算出自由基清除率為50%時(shí)樣品的劑量(IC50)，IC50值反映樣品對(duì)自由基的清除能力，IC50值越小，表明樣品清除自由基的能力越強(qiáng)。

1.3.4 瑪咖乙醇提取物清除羥自由基(·OH)能力測(cè)定

采用Fenton反應(yīng)體系[19-20]。10mL試管中依次加入0.5mL 9mmol/L FeSO4、0.5mL 9mmol/L水楊酸-乙醇溶液及不同體積樣品溶液(50～200μL)，0.01mol/L磷酸緩沖溶液(pH7.4)補(bǔ)充至5mL，最后加0.5mL 8.8mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃水浴反應(yīng)30min，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)量各濃度的吸光度。

式中：A0為未加樣品(以75%乙醇代替樣品)的空白對(duì)照液吸光度；Ai為加入瑪咖乙醇提取物后反應(yīng)體系的吸光度；Aj為不加H2O2的瑪咖乙醇提取物(以蒸餾水代替H2O2)本底的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)處理采用Excel 2003處理，結(jié)果采用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 瑪咖乙醇提取物總還原能力

圖1 瑪咖乙醇提取物鐵離子總還原能力Fig.1 Total antioxidant activity of ethanol extracts of different color types of maca

總還原力FRAP值越大，表明抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)，抗氧化活性越高[22]。由圖1的FRAP值可見，不同顏色瑪咖均具有抗氧化活性，但其還原能力有一定差異。除3000m海拔處黃色瑪咖提取物還原力略高于紫色外，其余海拔條件下種植的瑪咖提取物的還原能力均為紫色＞黃色＞白色。3種顏色瑪咖的總還原能力均為海拔3200m種植的樣品最強(qiáng)，白色和黃色瑪咖乙醇提取物的總還原能力隨種植地海拔的升高而增強(qiáng)；紫色瑪咖乙醇提取物除3000m外，其余樣品的總還原能力也隨種植地海拔的升高而增強(qiáng)。

2.2 瑪咖乙醇提取物清除DPPH自由基能力

DPPH自由基方法操作簡(jiǎn)便且靈敏度高，在天然抗氧化物研究中應(yīng)用較為普遍[22]。由表1可知，不同顏色瑪咖的乙醇提取物均具有清除DPPH自由基的能力，清除率隨劑量的增加而增強(qiáng)，具有一定量效關(guān)系。不同海拔種植的白色瑪咖提取物對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到大于80%時(shí)的劑量分別為80μL(2000m)、60μL(2500m和3000m)及40μL(3200m)；黃色、紫色瑪咖提取物對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到大于80%時(shí)的劑量分別為60μL(2000m和2500m)及40μL(3000m和3200m)，可見3種顏色瑪咖提取物具有隨種植地海拔增高而清除DPPH自由基的能力增強(qiáng)的趨勢(shì)。

圖2 瑪咖乙醇提取物清除DPPH自由基能力的IC50值Fig.2 IC50of ethanol extracts of different color types of maca for scavenging DPPH free radicals

由圖2可知，隨著種植地海拔的增高，3種顏色瑪咖的IC50值總體上呈下降趨勢(shì)，清除DPPH自由基的能力逐漸增強(qiáng)；相同海拔條件的黃色和紫色瑪咖的IC50值低于白色瑪咖，表明黃色和紫色瑪咖清除DPPH自由基的能力較強(qiáng)。

2.3 瑪咖乙醇提取物清除·OH能力

圖3 瑪咖乙醇提取物清除·OH的IC50值Fig.3 IC50of ethanol extracts of different color types of maca for scavenging hydroxyl free radicals

表1 瑪咖乙醇提取物對(duì)DPPH自由基抑制率的影響Table 1 Scavenging effects of ethanol extracts of different color types of maca on DPPH free radicals

表2 瑪咖乙醇提取物對(duì)·OH抑制率Table 2 Scavenging effects of ethanol extracts of different color types of maca on hydroxyl free radicals

表3 瑪咖乙醇提取物清除O－2·能力Table 3 Scavenging effects of ethanol extracts of different color types of maca for scavenging superoxide ion free radicals

羥自由基是人體中最活潑、對(duì)機(jī)體危害最大的自由基[23]。由表2可見，4種海拔條件下3種顏色的瑪咖提取物清除·OH的能力均較強(qiáng)，且隨劑量的增加而增強(qiáng)，當(dāng)劑量為200μL時(shí)，各種顏色瑪咖提取物對(duì)·OH清除率均達(dá)到90%以上，其中2500m處種植的紫色瑪咖在劑量為175μL時(shí)其抑制率達(dá)到91.68%，清除能力最好。

由圖3可見，3000m海拔地區(qū)種植的黃色瑪咖IC50值最低；2000m和2500m海拔的紫色瑪咖的IC50值低于白色和黃色瑪咖；而3000m和3200m的黃色瑪咖的IC50值低于其他2種顏色瑪咖，但差別不明顯。結(jié)果表明3種顏色的瑪咖提取物清除·OH的能力差別不大。

2.4 瑪咖乙醇提取物清除O·能力

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用FRAP、清除羥自由基、清除DPPH自由基及清除超氧陰離子自由基4種方法對(duì)云南引種瑪咖樣品的乙醇提取物進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，云南種植的3種顏色瑪咖均表現(xiàn)出抗氧化活性，且具有量效關(guān)系，抗氧化能力隨樣品劑量的增加而增強(qiáng)。對(duì)不同的抗氧化體系，3種顏色瑪咖抗氧化能力存在一定差別。紫色瑪咖總還原能力最強(qiáng)，黃色次之，白色最弱；紫色和黃色瑪咖清除DPPH自由基能力高于白色；3種顏色瑪咖對(duì)羥自由基的清除能力明顯。研究結(jié)果說明在云南不同地區(qū)種植的3種顏色瑪咖與原產(chǎn)秘魯?shù)默斂б粯泳哂锌寡趸锘钚?，表明在云南不同地區(qū)具有發(fā)展瑪咖種植產(chǎn)業(yè)的條件。

Sandoval等[15]、Leea[16]等的研究結(jié)果證實(shí)瑪咖水、甲醇提取物具有抗氧化活性，但其實(shí)驗(yàn)中未涉及不同顏色瑪咖的抗氧化活性比較。Gonzales[24]、Gasco[25]等通過喂養(yǎng)瑪咖對(duì)小鼠日精子量等方面影響的研究，比較了紅色、黑色和黃色瑪咖水提物的生物活性，發(fā)現(xiàn)3種顏色的瑪咖在生物活性的表現(xiàn)上存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)不同顏色的瑪咖在不同氧化體系中表現(xiàn)出一定的抗氧化能力差異，進(jìn)一步證實(shí)不同顏色的瑪咖生物活性存在一定差異。不同顏色瑪咖抗氧化活性的差異，表明其活性成分可能有所不同，引起活性差異的具體成分待進(jìn)一步分析確定。從抗氧化能力考慮黃色和紫色瑪咖要優(yōu)于白色瑪咖，可以優(yōu)先考慮在云南地區(qū)種植黃色和紫色瑪咖。

瑪咖原產(chǎn)地是秘魯3500m以上安第斯高寒山區(qū)，屬高山植物[26]。海拔的變化可引起土壤、光照、溫度、水質(zhì)、雨量等植物生長(zhǎng)的相關(guān)生態(tài)因子的變化[27]，對(duì)分布于不同產(chǎn)地或海拔高度的同種植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生存在一定的影響[28]。劉雷等[27]對(duì)峨眉山不同海拔和山峪魚腥草的揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同山峪及海拔高度對(duì)各魚腥草揮發(fā)油成分和含量具有顯著性影響。汪曉峰等[29]比較了四裂紅景天和長(zhǎng)鱗紅景天葉片中抗氧化系統(tǒng)隨海拔梯度的變化，發(fā)現(xiàn)紅景天內(nèi)抗氧化保護(hù)酶的活性及含量隨海拔升高有不同程度的提高。本研究發(fā)現(xiàn)瑪咖的體外抗氧化活性與其種植的海拔具有一定的關(guān)系，推測(cè)海拔變化伴隨著瑪咖生長(zhǎng)環(huán)境的改變，有可能造成瑪咖體內(nèi)一些與抗氧化活性相關(guān)的物質(zhì)積累的變化，從而使得其抗氧化能力出現(xiàn)一定的差異，對(duì)不同抗氧化體系的結(jié)果也不同。

本研究顯示瑪咖的乙醇提取物同水提物[15]、甲醇提取物[16]一樣均具有抗氧化活性，抗氧化成分可能屬于極性化合物。研究認(rèn)為高等植物中存在的類黃酮多酚類等次生代謝物具有較強(qiáng)的自由基清除能力，對(duì)人體健康具有積極的作用[30]。瑪咖乙醇提物中起抗氧化作用的物質(zhì)是否屬于黃酮多酚類物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

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in vitro Antioxidant Activity of Ethanol Extract of Maca (Lepidium meyenii Walpers) Cultivated in Yunnan

HE Zhao，F(xiàn)ENG Ying*，XU Long-feng，SUN Long，SHI Lei，CHEN Xiao-ming，ZHANG Zhong-he
(Key Laboratory of Breeding and Utilization of Resource Insects of State Forest Administration, Research Institute of Resource Insects of Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China)

Q949.748；TS218

A

1002-6630(2010)15-0039-05

2009-12-30

國(guó)家林業(yè)局“948”項(xiàng)目(2008-4-13)；中國(guó)林業(yè)科學(xué)院資源昆蟲研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(Riri200704M)

何釗(1976—)，男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物。E-mail：zhe999@hotmail.com

*通信作者：馮穎(1960—)，女，研究員，博士，研究方向?yàn)樗幱美ハx和天然產(chǎn)物。E-mail：yingf@hotmail.com