王 威，左雙海，程 超,2,*

(1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

貢水白柚柚皮乙醇提取物的體外抗氧化作用

王 威1，左雙海1，程 超1,2,*

(1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

對貢水白柚柚皮乙醇提取物的體外抗氧化作用進(jìn)行研究，同時與椪柑皮乙醇提取物、VC、沒食子酸丙酯(PG)等物質(zhì)的抗氧化作用進(jìn)行對比。結(jié)果表明：在水楊酸體系中椪柑皮乙醇提取物上清液、VC和PG對羥自由基的清除能力分別是貢水白柚柚皮乙醇提取物上清液的5.515、1.320、0.428倍；而椪柑皮乙醇提取物結(jié)晶、VC和PG分別是貢水白柚柚皮乙醇提取物結(jié)晶部分清除能力的17.407、1.586、0.514倍。在鄰二氮菲體系中貢水白柚柚皮乙醇提取物對自由基的清除作用均弱于椪柑皮、PG和VC，其中椪柑皮乙醇提取物上清液、PG和VC分別是貢水白柚柚皮乙醇提取物上清液清除能力的18.416、4.820、1.716倍；而椪柑皮乙醇提取物結(jié)晶、PG和VC是貢水白柚柚皮乙醇提取物結(jié)晶清除能力的6.589、3.609、1.285倍。椪柑皮乙醇提取物上清液、PG和VC對超氧陰離子自由基的清除作用分別是貢水白柚柚皮乙醇提取物上清液的13.941、1.059、2.442倍；椪柑皮乙醇提取物結(jié)晶、PG和VC是貢水白柚柚皮乙醇提取物結(jié)晶的5.908、1.471、3.392倍。貢水白柚柚皮乙醇提取物具有一定的還原力，但弱于椪柑皮乙醇提取物、PG和VC。

貢水白柚；椪柑；抗氧化作用；羥自由基；超氧陰離子自由基；還原力

Abstract：In this study, the in vitro antioxidant effect of the 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel was assessed and compared with those of the 80% ethanol extract from ponkan peel, VC, propyl gallate (PG). The results were showed that the scavenging abilities of the 80% ethanol extract (supernatant) from ponkan peel, VC and PG against hydroxyl free radicals trapped with salicylic acid were 5.515 and 1.320 times higher and 0.428 lower than that of the 80% ethanol extract (supernatant)from Gongshui white pomelo peel, while the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from ponkan peel, VC and PG were 17.407 and 1.586 times higher and 0.514 times lower than that of the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel, respectively. The scavenging abilities of the 80% ethanol extract from ponkan peel, PG and VC against hydroxyl free radicals generated in Fe2+/H2O2 reaction system were 18.416, 4.820 and 1.716 times higher than that of the 80%ethanol extract from Gongshui white pomelo peel, and the hydroxyl free radical scavenging abilities of the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from ponkan peel, PG and VC were 6.589, 3.609 and 1.285 times higher than that of the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel, respectively. In superoxide anion free radical scavenging ability, the 80% ethanol extract from ponkan peel, PG and VC were 13.941, 1.059 and 2.442 higher than the 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel and the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from ponkan peel, PG and VC were 5.908,1.471 and 3.392 times higher than the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel. The 80%ethanol extract from Gongshui white pomelo peel had the potential to reduce ferric ions, but its reducing power was weaker than those of 80% ethanol extract from ponkan peel, VC and PG.

Key words：Gongshui white pomelo；ponkan；antioxidation；hydroxy radical；superoxide anion radical；reducing power

近幾十年來，柚子的營養(yǎng)學(xué)價值不斷得到研究。李春美等[1]研究表明在菜油油脂體系中柚皮黃酮的抗氧化效果強于VC和BHT；楊曉泉等[2]發(fā)現(xiàn)柚皮黃酮對DPPH自由基具有清除作用，并且認(rèn)為主要抗氧化成分是圣草次苷；彭述輝等[3]研究表明梁平柚水提液對超氧陰離子自由基的作用效果優(yōu)于VC；楊轉(zhuǎn)琴等[4]研究表明在DPPH體系中沙田柚柚皮黃酮對自由基的清除率相當(dāng)于VC和BHT的81.02%和95.44%；吳瓊英等[5]研究表明蜜柚皮黃酮對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除作用均弱于VC。徐貴華等[6]對椪柑、溫州蜜橘中多酚類物質(zhì)的抗氧化作用進(jìn)行研究，表明在ABTS體系中，溫州蜜橘果皮提取液與椪柑皮的抗氧化效果相當(dāng)；但是在FRAP體系中，溫州蜜橘果皮提取液的抗氧化效果強于椪柑皮。由此可見，不同柚皮中的物質(zhì)在不同抗氧化體系中的抗氧化能力是不同的。

宣恩縣貢水白柚基地5萬畝，2008年產(chǎn)量超過0.6萬t。而目前對白柚的研究大多在貢水白柚的栽培及品種培育方面，鑒于目前宣恩白柚的種植、生產(chǎn)已成規(guī)模，柚子去皮銷售已成趨勢，因此，對貢水白柚柚皮研究具有現(xiàn)實意義。本實驗對貢水白柚柚皮的乙醇提取物的抗氧化作用進(jìn)行研究，并與椪柑皮的抗氧化作用對比，以期為柚皮的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貢水白柚購于湖北省宣恩縣，取柚皮于60℃烘干，粉碎備用；椪柑購于湖北省恩施市某超市，取椪柑皮于60℃烘干，粉碎備用。

甲醇、乙醇、水楊酸、鐵氰化鉀、鄰二氮菲、蘆丁、三(羥甲基)氨基甲烷、香草醛、溴水、濃鹽酸、FeSO4、H2O2、三氯乙酸、氯化鐵、酒石酸鐵、沒食子酸丙酯(PG)等。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-56MC紫外-可見分光光度計 上海第三分析儀器廠；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DL-5低速大容量離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；FD-155真空冷凍干燥機 北京林博醫(yī)康公司。

1.3 方法

1.3.1 柚皮乙醇提取物的提取工藝流程

貢水白柚柚皮(椪柑皮)→粉碎→80%乙醇回流提取(料液比1:15(m/V)，提取兩次)→4800r/min離心15min→合并上清液→旋轉(zhuǎn)濃縮至原體積的1/5→濃縮液置4℃冰箱靜置48h→4800r/min離心15min→分別取上清液和結(jié)晶體冷凍干燥制得的粗品。

1.3.2 柚皮乙醇提取物黃酮和多酚類物質(zhì)定性和定量測定

0.2 mg/mL 95%乙醇溶液在200～400nm進(jìn)行紫外掃描。樣品分別用三氯化鐵、溴水、明膠和香草醛-鹽酸等試劑進(jìn)行鑒別反應(yīng)[7]。

黃酮含量測定：Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法[8]。以蘆丁為標(biāo)樣作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蘆丁含量(mg)為x，A510nm的吸光度為y，得回歸方程為y=1.157x，r=0.9998。

多酚含量測定：酒石酸鐵比色法[9]。

1.3.3 柚皮乙醇提取物的體外抗氧化作用

1.3.3.1 在水楊酸體系中柚皮乙醇提取物對羥自由基的清除作用

參考顧海峰等[10-11]的方法，略有修改。在25mL試管中加入10mmol/L水楊酸-乙醇1mL、1.5mmol/L FeSO4溶液1mL、6mmol/L H2O2溶液1mL，加乙醇補至4mL，測其吸光度(A0)。取5支試管，加入水楊酸-乙醇1mL、FeSO4溶液1mL、6mmol/L H2O21mL、不同體積的樣品稀釋液，加乙醇補足至4mL，測其吸光度(Ax)。另一組加入水楊酸-乙醇1mL、FeSO4溶液1mL、不同體積的樣品稀釋液，乙醇補足4mL，測其吸光度(Ax0)，吸光度測定波長均為510nm。

式中：A0為未加清除劑的吸光度；Ax為加入清除劑的吸光度；Ax0為樣品的本底吸光度。

1.3.3.2 在鄰二氮菲體系中柚皮乙醇提取物對羥自由基的清除作用[12]

取1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管中，依次加入2mL 0.2mol/L的磷酸緩沖液(pH7.4)和0.2mL乙醇，充分混勻，加入1mL新配制的0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液，混勻后加入 1mL新配制的0.01%的雙氧水，于37℃水浴加熱60min后，在536nm波長處測定吸光度，所測得的吸光度為A損傷。操作方法同損傷管，但以1mL 70%乙醇代替損傷管中雙氧水，可測得A空白。樣品管以0.2mL樣品量代替損傷管中的蒸餾水，操作方法同損傷管，可測得A樣品，則清除率按公式(2)計算。

1.3.3.3 柚皮乙醇提取物對超氧陰離子自由基的清除作用[12]

取4.5mL pH8.20 50mmol/L Tris-HCl緩沖液、4.2mL蒸餾水，混勻后在室溫下保持20min，取出后立即加入3mmol/L的鄰苯三酚溶液(以10mmol/L的HCl溶液配制，空白管用10mmol/L的HCl溶液代替鄰苯三酚溶液)0.3mL，迅速搖勻后倒入比色皿，在325nm波長處每隔30s測定吸光度(A0)，計算線形范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加(ΔA0)。加入鄰苯三酚前，先加入一定體積的樣品溶液，蒸餾水減少，同上述方法測定加入樣品后線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加ΔA，再按式(3)計算抑制率。

1.3.3.4 柚皮乙醇提取物的還原力測定[7]

取1mL待測液，加入pH6.6的磷酸緩沖液2.5mL和1g/100mL 鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合后在50℃放置20min，加入10g/100mL氯乙酸溶液2.5mL，4800r/min離心10min，取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.1g/100mL氯化鐵2.5mL，混勻，在700nm波長處測定吸光度。還原力的IC50值為還原力達(dá)到0.5時的樣品質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 椪柑皮和柚皮乙醇提取物的定性實驗結(jié)果

2.1.1 紫外掃描

圖1 椪柑皮乙醇提取物的紫外掃描圖譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectra of the 80% ethanol extract from ponkan peel and its freeze dried crystal

圖1為椪柑皮乙醇提取物的吸收峰的位置，圖2為貢水白柚柚皮乙醇提取物的掃描圖譜，其中上清液和結(jié)晶體均有3個吸收峰，其中結(jié)晶體中吸收峰的波長位置在232、278、335nm，上清液為230、285、330nm。貢水白柚柚皮和椪柑皮提取液的紫外吸收光譜中，在330nm左右(譜帶I)、280nm左右(譜帶II)和225nm左右(譜帶III)，3個波長區(qū)域有明顯的吸收峰，與黃酮類和黃酮醇類的吸收光譜很相似，都有320～380nm的譜帶I區(qū)域和240～270nm的譜帶II區(qū)域，一般情況下黃酮類植物成分(320～350nm)的譜帶I 區(qū)域只有1個吸收峰，如果B 環(huán)的4′位有羥基則譜帶I只有1個吸收峰，若4′和3′位上都有羥基或甲氧基則譜帶II區(qū)可能出現(xiàn)兩個吸收峰，或1個大的吸收峰和另1個較平坦的曲折[4,13-14]。本實驗結(jié)果的掃描圖譜中出現(xiàn)了幾個不同的吸收峰，其原因可能是由于樣品沒有進(jìn)行深度分離純化，可能在黃酮樣品中仍存在多酚類物質(zhì)。

圖2 貢水白柚柚皮乙醇提取物的紫外掃描圖譜Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of the 80% ethanol extract fromGongshui white pomelo peel and its freeze dried crystal

2.1.2 鑒定實驗

表1 定性鑒定表Table 1 Qualitative identification of the 80% ethanol extract from ponkan peel and its freeze dried crystal and the 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel and its freeze dried crystal

由表1可知，貢水白柚皮乙醇提取物上清液和椪柑皮乙醇提取物結(jié)晶與香草醛-HCl反應(yīng)均顯示紅色，這表示其中含有黃烷醇類物質(zhì)[15-16]。同時與溴水、明膠等發(fā)生反應(yīng)也說明其中含有較多的多酚類物質(zhì)。

表2 樣品中黃酮、多酚的測定結(jié)果Table 2 Contents of flavonoids and polyphenols of the 80% ethanol extract from ponkan peel and its freeze dried crystal and the 80%ethanol extract from Gongshui white pomelo peel and its freeze dried crystal

將貢水白柚柚皮和椪柑皮乙醇提取物上清液冷凍干燥樣品分別配制成3mg/mL的溶液，同時將貢水白柚柚皮和椪柑皮乙醇提取物結(jié)晶樣品配制成0.7mg/mL的溶液，分別對樣品溶液中的黃酮和多酚類物質(zhì)進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，貢水白柚柚皮乙醇提取物上清液中黃酮含量高于椪柑皮的，而多酚含量則遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于椪柑皮。

2.2 柚皮乙醇提取物在水楊酸體系中對羥自由基的清除作用

貢水白柚柚皮乙醇提取物和椪柑皮乙醇提取物在水楊酸體系中對羥自由基的清除作用見圖3和表3、4。通過對比可發(fā)現(xiàn)，無論是貢水白柚柚皮乙醇提取物的上清液還是結(jié)晶體部分，其在水楊酸體系對羥自由基的清除能力均強于PG，PG對羥自由基的清除能力僅僅是貢水白柚柚皮乙醇提取物的上清液和結(jié)晶體的0.428和0.514；但是弱于椪柑皮乙醇提取物的上清液和結(jié)晶部分以及VC，其中椪柑皮乙醇提取物上清液和VC的清除能力是貢水白柚柚皮的5.515倍和1.320倍。而椪柑皮乙醇提取物結(jié)晶部分和VC則是貢水白柚柚皮的17.407倍和1.586倍。

圖3 水楊酸體系中對羥自由基的清除作用Fig.3 Scavenging abilities of the 80% ethanol extract from ponkan peel and its freeze dried crystal, the 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel and its freeze dried crystal, VC and PG against hydroxyl free radicals tapped with salicylic acid

表3 水楊酸體系中上清液樣品對羥自由基的清除作用Table 3 Regression equations showing the concentration dependence of scavenging abilities of the 80% ethanol extract from ponkan peel, the 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel, VC and PG against hydroxyl free radicals trapped with salicylic acid

表4 結(jié)晶體樣品對羥自由基的清除作用Table 4 Regression equations showing the concentration dependence of scavenging abilities of the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from ponkan peel, the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel, VC and PG against hydroxyl free radicals trapped with salicylic acid

2.3 柚皮乙醇提取物在鄰二氮菲體系中對羥自由基的清除作用

貢水白柚柚皮乙醇提取物和椪柑皮乙醇提取物在鄰二氮菲體系中對羥自由基的清除作用見圖4和表5、6。貢水白柚皮提取物的上清液和結(jié)晶部分在鄰二氮菲體系對羥自由基的清除作用均弱于椪柑皮提取物的上清液和結(jié)晶體以及PG、VC；分別以貢水白柚柚皮乙醇提取物上清液和結(jié)晶體的IC50為標(biāo)準(zhǔn)，椪柑皮乙醇提取物、PG、VC與其相比抗氧化倍數(shù)見表5、6。

圖4 鄰二氮菲體系中上清液樣品對羥自由基的清除作用Fig.4 Scavenging abilities of the 80% ethanol extract from ponkan peel and its freeze dried crystal, the 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel and its freeze dried crystal, VC and PG against hydroxyl free radicals generated in Fe2+/H2O2reaction system

表5 鄰二氮菲體系中上清液樣品對羥自由基的清除作用Table 5 Regression equations showing the concentration dependence of scavenging abilities of the 80% ethanol extract from ponkan peel, the 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel, VC and PG against hydroxyl free radicals generated in Fe2+/H2O2reaction system

表6 鄰二氮菲體系中結(jié)晶體樣品對羥自由基的清除作用Table 6 Regression equations showing the concentration dependence of scavenging abilities of the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from ponkan peel, the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel, VC and PG against hydroxyl free radicals generated in Fe2+/H2O2reaction system

2.4 柚皮乙醇提取物對超氧陰離子自由基的清除作用

由圖5可以看出，貢水白柚柚皮乙醇提取物和椪柑皮乙醇提取物對超氧陰離子自由基具有較強清除作用且有劑量效應(yīng)關(guān)系。由表7、8可知，貢水白柚柚皮乙醇提取物上清液和結(jié)晶體部分對超氧陰離子自由基的清除作用均弱于椪柑皮乙醇提取物的上清液和結(jié)晶部分以及PG、VC。

圖5 樣品對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.5 Reducing power of the 80% ethanol extract from ponkan peel and its freeze dried crystal, the 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel and its freeze dried crystal, VC and PG against superoxide anion free radicas

表7 上清液樣品對超氧陰離子自由基的清除作用Table 7 Regression equations showing the concentration dependence of scavenging abilities of the 80% ethanol extract from ponkan peel, the 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel, VC and PG against superoxide anion free radicals

表8 結(jié)晶樣品對超氧陰離子自由基的清除作用Table 8 Regression equations showing the concentration dependence of scavenging abilities of the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from ponkan peel, the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel, VC and PG against superoxide anion free radicals

2.5 柚皮乙醇提取物的還原力

圖6 樣品還原力的作用Fig.6 Reducing power of the 80% ethanol extract from ponkan peel and its freeze dried crystal, the 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel and its freeze dried crystal, VC and PG

表9 上清液樣品的還原力Table 9 Regression equations showing the concentration dependence of reducing power of the 80% ethanol extract from ponkan peel, the 80%ethanol extract from Gongshui white pomelo peel, VC and PG

表10 結(jié)晶樣品的還原力Table 10 Regression equations showing the concentration dependence of reducing power of the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from ponkan peel, the freeze dried crystal of 80% ethanol extract from Gongshui white pomelo peel, VC and PG

貢水白柚柚皮乙醇提取物和椪柑皮黃酮乙醇提取物的還原力見圖6。根據(jù)表9、 10中以貢水白柚柚皮相比的抗氧化活性可看出，貢水白柚柚皮乙醇提取物上清液和結(jié)晶部分的還原力弱于椪柑皮乙醇提取物、PG和VC。

3 結(jié) 論

根據(jù)以上實驗，可以看出貢水白柚柚皮乙醇提取物的抗氧化作用均弱于椪柑皮的，通過對其多酚類物質(zhì)的測定發(fā)現(xiàn)，貢水白柚柚皮乙醇提取物上清液中多酚類物質(zhì)的含量遠(yuǎn)低于椪柑皮的，但黃酮類的含量卻正好相反，所以有可能多酚類物質(zhì)在椪柑皮的抗氧化作用方面起了重要的作用[15]。同時根據(jù)上述結(jié)果也可發(fā)現(xiàn)，貢水白柚柚皮乙醇提取物上清液和結(jié)晶部分抗氧化能力均弱于VC，除了在水楊酸體系中貢水白柚皮上清液和結(jié)晶部分對羥自由基的清除作用強于PG外，其他均弱于PG。

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in vitro Antioxidant Effect of Ethanol Extract from Gongshui White Pomelo Peel

WANG Wei1， ZUO Shuang-hai1，CHENG Chao1,2,*
(1. School of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationallities, Enshi 445000, China；2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)15-0143-06

2010-03-25

湖北省生物資源開發(fā)與利用重點實驗室開放課題(2007016)

王威(1987—)，男，本科生，研究方向為生物資源的開發(fā)與利用。E-mail：wangwei0730@163.com

*通信作者：程超(1976—)，女，副教授，博士研究生，研究方向為生物資源的開發(fā)與利用。E-mail：chengchaow@126.com