李遠宏，呂鳳霞，鄒曉葵，李 穎,2，陸兆新,*

(1.南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.無錫市宜興食品藥品監(jiān)督管理局，江蘇 宜興 214206)

鮮奶中產γ-氨基丁酸乳酸菌株的篩選與鑒定

李遠宏1，呂鳳霞1，鄒曉葵1，李 穎1,2，陸兆新1,*

(1.南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.無錫市宜興食品藥品監(jiān)督管理局，江蘇 宜興 214206)

從新鮮牛奶中篩選高產γ-氨基丁酸(GABA)的乳酸菌株fmbl12-4，通過形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA 序列分析，鑒定菌株為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)。當fmbl12-4的濕菌體與100mmol/L L-谷氨酸鈉溶液(L-MSG)按1:20(m/V)混合，于30℃、100r/min振蕩反應24h，轉化液中GABA濃度達到82.36mmol/L。在質量濃度為2.5g/100mL L-MSG的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)6d，GABA質量濃度達到4.68g/L。

γ-氨基丁酸；乳酸菌；篩選；鑒定

Abstract ：A lactic acid bacterial strain with high γ-aminobutyric acid (γ-GABA)-producing ability, named fmbl12-4, was isolated from fresh milk. Based on the studies of morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence and phylogenic analyses, fmbl12-4 was identified as Lactococcus lactis subsp. lactis. After 24 h shake (100 r/min)incubation of the wet mycelia of fmbl12-4 in a 20-fold volume of 100 mmol/L L-monosodium glutamate solution at 30 ℃, aγ-GABA content of 82.36 mmol/L was obtained. Incubation in a MRS medium containing 25 g/L L-MSG for 6 days gave 4.68 g/L γ-GABA content.

Key words：γ-aminobutyric acid；lactic acid bacteria；isolation and screening；identification

γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然存在的非蛋白質組成氨基酸，廣泛存在于原核生物和真核生物中[1]。GABA是哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中一種重要的抑制性神經遞質，具有很多重要的生理功能，如降低血壓、利尿、鎮(zhèn)靜安神、促進睡眠、增強記憶力、預防糖尿病、治療癲癇、促進生殖[2]等。作為一種新型的功能性因子，GABA在食品保健、醫(yī)藥、化工和農業(yè)等行業(yè)具有廣闊的應用前景。

制備GABA的方法主要有化學合成法和生物合成法，其中生物合成法又包括植物富集法和微生物發(fā)酵法。生物合成法是利用生物體內的谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)作為催化劑，將L-谷氨酸(L-Glu)或其鈉鹽α-脫羧生成GABA。相比而言，化學合成GABA安全性差、環(huán)境污染嚴重。植物富集的GABA含量較低，微生物發(fā)酵法制備GABA由于不受資源、環(huán)境和空間的限制，具有明顯優(yōu)勢。

乳酸菌是具保健作用的益生菌，是一種公認安全的微生物，廣泛地應用于食品工業(yè)中。目前，Lactobacillus plantarum[3]、Lactobacillus brevis[4]、Lactococcus lactis[5]、Lactobacillus paracasei[6]、Streptococcus salivarius subsp. thermophilus[7]中已發(fā)現(xiàn)具有生物合成GABA的能力。從乳酸菌中篩選高產GABA的菌株是一個很好的策略。本研究從新鮮牛奶中篩選高產GABA的乳酸菌菌株，對其進行鑒定，并對其生理生化特性進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

γ-氨基丁酸(99.0%)、異硫氰酸苯酯 (PITC) Sigma公司；乙腈、乙酸、三乙胺(均為色譜純) Tedia公司；細菌總DNA提取試劑盒 上海生工生物工程技術服務有限公司；其他試劑為國產分析純級試劑。

乳酸菌分離培養(yǎng)基為含20g/L CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基[8]；菌種活化培養(yǎng)基為體積分數(shù)10%的脫脂牛乳培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基為含不同質量濃度L-谷氨酸鈉(L-MSG)的MRS液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100 series 高效液相色譜系統(tǒng)(全波長紫外檢測器) 美國安捷倫科技公司；5804R高速冷凍離心機德國Eppendorf 公司；LNG-T88臺式快速冷凍離心濃縮干燥器 太倉市華美生化儀器廠。

1.3 樣品中乳酸菌菌株分離培養(yǎng)及純化

新鮮牛奶取自安徽科技學院畜牧科技園。對樣品進行梯度稀釋，涂布于MRS平板上，于30℃培養(yǎng)48h。挑取肉眼可見、生長較快、單個有溶鈣圈的菌落分離并純化，根據(jù)菌落特征進行初步歸類，將革蘭氏染色陽性、無芽孢、接觸酶陰性菌株作為進一步篩選的乳酸菌疑似菌株，并將其編號、保存。

1.4 生產GABA菌株的篩選

1.4.1 菌種的活化培養(yǎng)

將上述分離純化并保存的菌株接種于脫脂牛乳培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至凝乳，然后按體積分數(shù)2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)16h。

1.4.2 細胞轉化

將活化后的菌種按體積分數(shù)2%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，于30℃靜置培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)物在5000r/min、4℃離心15min收集菌體，加入與培養(yǎng)液等量的生理鹽水洗滌菌體3次。濕菌體與100mmol/L的L-谷氨酸鈉溶液按1:20(m/V)充分混合均勻，于30℃、100r/min振蕩反應24h。取細胞轉化液進行定性分析，并對高產GABA的細胞轉化液進行定量分析。

1.5 分析方法

1.5.1 定性分析

采用紙層析法。展開劑組成：V(正丁醇):V(冰乙酸):V(水)=4:1:3，內含質量濃度為0.4g/100mL的茚三酮。以GABA標準品做參比，待測樣品點樣5μL。采用新華一號層析紙展開后于90℃條件下烘干顯色20min。

1.5.2 定量分析

高效液相色譜法測定參照文獻[9]進行，洗脫條件略有改動，洗脫程序如表1所示。色譜條件：色譜柱采用Agilent:ZORBAX.Eclips XDB-C18柱(15cm×4.6mm，5μm)，紫外檢測器，檢測波長為254nm。流動相：流動相A為乙酸鈉10.254g、三乙胺0.5mL和乙酸0.7mL，調節(jié)pH5.8，定容至1000mL；流動相B為乙腈；流動相C為水。標準曲線的制作：精密配制2.000mmol/L的GABA標準溶液，并將其稀釋至0.125、0.250、0.500、0.750、1.000mmol/L。對GABA標準樣品衍生化后定量測定，以GABA濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

表1 流動相梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program for HPLC determination ofγ-GABA

1.6 菌株鑒定

1.6.1 形態(tài)觀察及生理生化鑒定

按照參考文獻[8-10]進行。

1.6.2 16S rDNA 的擴增與測序

采用細菌總DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用細菌的16S rDNA通用引物進行PCR擴增。正向引物P1：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；反向引物P2：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。PCR 反應體系(總體積50μL)：10×PCR緩沖液5μL；正、反向引物P1、P2 均為10mmol/L各2.5μL；dNTP (10mmol/L)4μL；基因組DNA 1.0μL；Taq DNA聚合酶0.5μL；雙蒸水34.5μL。PCR 反應條件為：94℃預變性2min；94℃變性45s，55℃退火55s，72℃延伸2min，共進行34個循環(huán)；再72℃延伸10min。PCR產物測序由南京金思特生物技術公司完成。

1.6.3 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

將16S rDNA序列與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進行同源性分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。選擇同源性較高及已報道產GAD的細菌16S rDNA核苷酸序列，利用clustalx 2.0進行多重聯(lián)配，然后再利用MEGA 4.0軟件采用Neighbour-joining方法以E.coli O157:H7為外群(out-group)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行Bootstrap分析。

1.7 溫度對GABA積累的影響

將活化的產GABA菌株以體積分數(shù)2%的接種量，接入含質量濃度為2.5g/100mL的L-MSG的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于25、30、37、40℃靜置培養(yǎng)。每24h測定發(fā)酵液中GABA的質量濃度。

1.8 底物質量濃度對GABA積累的影響

將活化的產GABA菌株以2%的接種量，分別接入含質量濃度為0.5、1、2.5、5g/100mL的L-MSG的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃靜置培養(yǎng)。每24h測定發(fā)酵液中GABA的質量濃度。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離及純化

從新鮮牛奶中分離出大量疑似乳酸菌株，對革蘭氏陽性、無芽孢、接觸酶陰性的菌株產GABA能力進行研究。為了能夠從分離的大量疑似乳酸菌菌株中篩選到高產GABA菌株，共對60株疑似乳酸菌菌株進行了分離、純化，并作為產GABA菌株的篩選對象。

2.2 產GABA乳酸菌菌株的篩選

2.2.1 定性分析

圖1 菌株轉化液紙層析圖譜Fig.1 Paper chromatographic patterns showing the production ofγ-GABA derived from strain fmbl12-4 incubated in L-monosodium glutamate solution

如圖1所示，菌株fmbl12-4的細胞轉化液存在明顯與GABA標準品Rf一致的茚三酮顯色斑點。初步判定菌株fmbl12-4為產GABA菌株。

2.2.2 定量分析

圖2 GABA標準品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram ofγ-GABA standard

按照參照文獻[9]提供的方法處理GABA標準品，再進行HPLC測定，以峰面積(y)對GABA濃度(x)作線性回歸，制作GABA標準曲線，結果在GABA濃度為 0～1mmol/L范圍內，GABA獲得了良好的分離，其線性方程為y=23871x+89.099(R2=0.9993)。通過HPLC定量測定樣品中的GABA質量濃度，由此確定菌株產GABA的能力。結果發(fā)現(xiàn)菌株fmbl12-4的細胞轉化液中均存在一種與GABA標準樣品保留時間相同的物質，進一步證明了菌株fmbl12-4具有轉化底物L-MSG合成GABA的能力。菌株fmbl12-4細胞轉化液中的L-MSG幾乎全部被轉化，GABA質量濃度達到82.36mmol/L，GABA標準樣品及細胞轉化液的高效液相色譜圖譜如圖2、3所示。

圖3 菌株fmbl12-4細胞轉化液的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of the metabolic products after incubation of strain fmbl12-4 in L-monosodium glutamate solution

2.3 菌株fmbl12-4的鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)特征

菌株fmbl12-4在MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，其菌落表面光滑、濕潤、呈乳白色、邊緣整齊，直徑約1mm，經革蘭氏染色鏡檢為陽性，符合乳酸菌特性。

2.3.2 生理生化特性

參照文獻[8，10]對菌株fmbl12-4進行生理生化實驗，結果見表2。各項檢測特征均符合文獻[8，10]中關于乳酸乳球菌的描述，初步判定菌株fmbl12-4為乳酸乳球菌。

表2 菌株fmbl12-4生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain fmb12-4

2.3.3 分子生物學鑒定

2.3.3.1 16S rDNA擴增與測序

以菌株fmbl12-4的總DNA為模板，P1、P2為引物，進行 PCR擴增，得到約1.5kb左右的特異性擴增條帶。擴增產物經南京金思特生物技術公司測序，核苷酸序列大小為1425bp。該序列已經在Genbank上進行了登記，登記號為FJ824739.1。

2.3.3.2 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株fmbl12-4的16S rDNA核苷酸序列分別與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 數(shù)據(jù)庫中報道的16S rDNA核苷酸序列進行比對，結果顯示，菌株fmbl12-4的16S rDNA核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫報道的5種菌株的16S rDNA核苷酸序列的同源性達到99%，分別為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. cremoris)、格氏乳桿菌(Lactococcus garvieae)、根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、耐久腸桿菌(Enterococcus durans)以及11株不可培養(yǎng)微生物。其中明確種屬的有Lactococcus lactis subsp. lactis、Lactococcus lactis subsp. cremoris、Lactococcus garvieae、Agrobacterium tumefaciens、Enterococcus durans。選擇已報道產GAD的細菌16S rDNA核苷酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖4所示。

圖4 基于具有GAD活性細菌的16S rDNA序列為基礎的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences based on the 6S rDNA sequences of bacterial strains with GAD activity

由圖4可知，fmbl12-4與Lactococcus lactis subsp.lactis位于同一個簇群，且同源性達99%的微生物大部分為Lactococcus lactis subsp. lactis，其他產GAD細菌的發(fā)育關系相對較遠。

根據(jù)fmbl12-4的形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列比對分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，將fmbl12-4鑒定為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)。

2.4 溫度對GABA積累的影響

GABA在生物體內的合成從本質上說是酶參與的催化反應，主要是GAD參與L-Glu或其鹽類α-羧基脫羧而合成的。不同溫度條件下GABA的積累情況如圖5所示。

由圖5可知，菌株fmbl12-4在30℃時的積累量最大，當溫度升高或降低，發(fā)酵液中GABA的積累量都有所降低。這可能是由于菌株fmbl12-4細胞內的GAD活性在30℃時相對較高。

圖5 溫度對GABA積累的影響Fig.5 Effect of incubation temperature on GABA production

2.5 底物質量濃度對GABA積累的影響

GABA是在GAD的催化作用下，將L-MSG的α-羧基脫羧而生成的。L-MSG作為生物合成GABA的前體，對發(fā)酵液中GABA的積累有重要影響。當培養(yǎng)基中添加不同質量濃度L-MSG時，發(fā)酵液中GABA的積累情況如圖6所示。

圖6 L-MSG質量濃度對GABA合成的影響Fig.6 Effect of L-MSG concentration on GABA production

由圖6可見，在發(fā)酵過程中，GABA的積累量隨著時間的延長不斷增加，在前4d GABA質量濃度增加較快，發(fā)酵后期GABA質量濃度增幅趨緩，基本趨于穩(wěn)定。當培養(yǎng)基中L-MSG的質量濃度較低時，發(fā)酵液中GABA的積累隨著L-MSG的增加而顯著增加；在含質量濃度為2.5g/100mL的L-MSG的MRS培養(yǎng)基中，菌株fmbl12-4對 GABA的最大積累量達到4.68g/L；而當L-MSG添加量達到5g/100mL時，發(fā)酵液中GABA的最大積累量為5.50g/L，GABA的積累量增加趨緩，發(fā)酵液中殘留的L-MSG相對較多。這可能是因為培養(yǎng)基中高質量濃度的L-MSG抑制了菌體生長，從而導致生物量降低。

3 結 論

由于反應液中僅加入底物L-MSG，成分簡單，同時GAD是生物催化L-Glu及其鹽類的α-羧基脫羧反應生成GABA的唯一酶[11]，因而最終細胞轉化液中僅存在底物L-MSG和(或)產物GABA，紙層析后表現(xiàn)為顯色條帶僅為一條或兩條，易于觀察，篩選效率大大提高。發(fā)酵液中的成分復雜，尤其是含有大量其他種類的氨基酸和蛋白質等產物也可以與茚三酮反應呈色，GABA顯色斑點易受干擾。相比于利用紙層析分析發(fā)酵液[12-15]中是否存在GABA來初步篩選GABA產生菌株而言，利用紙層析分析細胞轉化液是一種較為理想的初步篩選GABA生產菌株的方法。本實驗通過紙層析定性分析細胞轉化液中是否存在GABA，然后再對存在明顯GABA顯色斑點的細胞轉化液進行HPLC定量測定，進一步驗證菌株是否為GABA產生菌株的方法，從新鮮牛奶樣品中分離篩選了1株高產GABA的乳酸菌菌株fmbl12-4。當fmbl12-4的濕菌體與100mmol/L L-MSG 按1:20混合，于30℃、100r/min振蕩反應24h，轉化液中GABA濃度達到82.36mmol/L。在含質量濃度為2.5g/100mL的LMSG的MRS培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)6d，GABA質量濃度達到4.68g/L。通過形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA 序列分析鑒定菌株為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)。

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Isolation and Screening of a Gamma-Aminobutyric Acid-producing Lactic Acid Bacterial (LCB) Strain from Fresh Milk

LI Yuan-hong1，LFeng-xia1，ZOU Xiao-kui1，LI Ying1,2，LU Zhao-xin1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. Yixing Food and Drug Administration, Yixing 214206, China)

Q939

A

1002-6630(2010)15-0198-05

2009-10-27

國家“863”計劃項目(2007AA10Z357)

李遠宏(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：ahyhongl@sina.com

*通信作者：陸兆新(1957—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物和食品生物技術。E-mail：fmb@njau.edu.cn