胡純秋，高金燕，羅春萍，陳紅兵,*，朱 盼

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047)

重組花生過敏原Ara h 2的生物合成

胡純秋1,2，高金燕1,3，羅春萍1,2，陳紅兵1,2,*，朱 盼1,2

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047)

為獲得重組花生過敏原Ara h 2。通過RT-PCR合成cDNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因Ara h 2，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆至pMD19-T Simple載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-Ara h 2。上述重組質(zhì)粒經(jīng)酶切純化后定向克隆到pGEX-4T-1表達(dá)載體中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-Ara h 2，并轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21-codonPlus(DE3)-RIPL中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，該表達(dá)蛋白大小約為46kD，與理論值相符。通過Glutathione Sepharose 4B凝膠親和層析方法純化融合蛋白GST-Ara h 2，獲得融合蛋白純度約為90%。Western blotting分析表明，經(jīng)純化的融合蛋白能與抗Ara h 2兔血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說明該蛋白具有良好的免疫原性。

食物過敏；花生過敏原Ara h 2；生物合成

Abstract ：Ara h 2 is one of paramount allergens in peanut. The goal of the present study was to biosynthesize recombinant peanut allergen Ara h 2. Peanut cDNA was synthesized from total RNA using Oligo primers by RT-PCR in order to provide a template for the PCR amplification of Ara h 2 gene. The purified amplification products were cloned into the pMD19-T simple vector to construct a recombinant vector carrying Ara h 2 gene, named pMD19-T-Ara h 2. The recombinant plasmid was digested by Nco I and Hind III. The purified digestion products were then ligated to the pGEX-4T-1 expression vector and transformed into the BL21-codonPlus(DE3)-RIPL for 24 h expression under IPTG induction. The target product, GST-Ara h 2 fusion protein, was purified with Glutathione Sepharose 4B. The results of SDS-PAGE and western-blotting showed that GST-Ara h 2 fusion protein was 46 kD in size, with 90% purity and could specifically react with anti-Ara h 2 sera from rabbits, indicating that the recombinant protein has high specificity of immune reaction.

Key words：food allergy；peanut allergen Ara h 2；biosynthesis

花生是一種重要的食物過敏原，屬于世界糧農(nóng)組織(FAO)報(bào)告的八大過敏食物之一[1]。目前已發(fā)現(xiàn)11種花生過敏蛋白，其中，Ara h 1和Ara h 2被認(rèn)為是主要的花生過敏原，90%的花生過敏患者對(duì)其過敏[2-3]。Ara h 2是分子質(zhì)量為17～20kD同種異型蛋白[4]，約占花生蛋白總量的10%[5]，是花生中致敏性最強(qiáng)的組分之一[6]。成功地制備花生過敏原Ara h 2，尤其是重組蛋白的生物合成，可為Ara h 2進(jìn)一步相關(guān)研究提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)材料。同時(shí)對(duì)開發(fā)食品中花生過敏原Ara h 2檢測(cè)試劑等也具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為此，本實(shí)驗(yàn)擬以花生過敏原Ara h 2為對(duì)象，通過RT-PCR技術(shù)，克隆該基因并在原核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，利用Glutathione Sepharose 4B凝膠親和層析純化融合蛋白，探索制備花生過敏原Ara h 2的生物合成方法。

1 材料與方法

1.1 材料

花生產(chǎn)自江西省，為湘花花生品種，購(gòu)自江西省南昌市青山湖市場(chǎng)。

1.2 兔抗Ara h 2血清的采集

本血清為實(shí)驗(yàn)室自制并保存。主要方法是從花生種子中分離純化Ara h 2，并按常規(guī)方法免疫新西蘭大白兔，達(dá)到一定效價(jià)后采血，分離血清，－80℃保存。

1.3 質(zhì)粒和菌株

pMD19-T Simple載體 TaKaRa工程有限公司；pGEX-4T-1載體、大腸桿菌E.coli DH5α 本實(shí)驗(yàn)室保存；BL21-codonPlus(DE3)-RIPL Stratagene公司。

1.4 工具酶和試劑

RT-PCR cDNA第一鏈合成試劑盒、Cocktail片劑Roche公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ、Taq DNA聚合酶 TaKaRa工程有限公司；T4連接酶Promage公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒 天根公司；硝酸纖維素膜 Millipore公司；DNA Ladder Marker 北京全式金公司；低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker Fermentas公司；Glutathione Sepharose 4B Amersham公司；羊抗兔IgG酶標(biāo)二抗、4-氯-1-萘酚 Sigma公司；氨芐、IPTG、X-gal 上海生物工程有限公司。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已報(bào)道花生過敏原Ara h 2基因序列(登錄號(hào)AY158467)，設(shè)計(jì)了1對(duì)引物(下劃線對(duì)應(yīng)部分為酶切位點(diǎn))：P1(上游)：5′-CGGAATTCATGGCCAA GCTCACCATACTAGTA-3′(EcoR Ⅰ)；P2(下游)：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGTATCTGTCTCTGCC-3′(NotⅠ)。

1.6 儀器與設(shè)備

迷你型蛋白電泳儀、凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；PCR梯度擴(kuò)增儀 德國(guó)Biometra公司；ALLEGRA-64R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Backman公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物技術(shù)公司。

1.7 方法

1.7.1 總RNA的提取

具體方法見文獻(xiàn)[7]。

1.7.2 RT-PCR擴(kuò)增Ara h 2基因

以總RNA為模板，Oligo(dT)為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系：10×Reaction Buffer 2.0μL、MgCl2(25mmol/L)4.0μL、dNTP(10mmol/L)2.0μL、Oligo(dT)(0.8μg/μL)引物 2.0μL、RNase Inhibitor (50U/μL)1.0μL、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(≥2.5U/μL) 0.8μL、無RNase水5.2μL、總RNA樣品3.0μL。反應(yīng)條件為：25℃溫浴10min，42℃反應(yīng)1h，合成cDNA，然后99℃變性5min，最后4℃放置5min。再以此反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，P1、P2為特異性引物，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10×Reaction Buffer 10.0μL、dNTP(2.5mmol/L)8.0μL、引物P1/P2(60pmol/L)10.0μL、Taq酶(5U/μL)1.0μL、雙蒸水59.0μL、cDNA 2.0μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性30s；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7.3 Ara h 2基因的克隆及篩選

采用DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，操作步驟按說明書進(jìn)行。將純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定純度后，與pMD19-T Simple載體連接，16℃反應(yīng)1h，并轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD19-T-Ara h 2，鋪平板，過夜培養(yǎng)，篩選陽性克隆子，提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒采用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒及酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7.4 Ara h 2基因的測(cè)序、序列分析

將鑒定的陽性克隆質(zhì)粒送上海生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序，通過Blast比對(duì)進(jìn)行同源性分析。

1.7.5 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將經(jīng)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒及表達(dá)載體pGEX-4T-1，均用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，同時(shí)回收小片段及酶切后的載體。用T4連接酶連接兩個(gè)回收片段，轉(zhuǎn)化E. coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含氨芐的平板，挑菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，篩選陽性重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Ara h 2，并通過EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒及酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7.6 Ara h 2基因的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測(cè)

將經(jīng)鑒定為陽性的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21-codonPlus(DE3)-RIPL中，涂布于含氨芐的平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑單菌落接種于2mL含氨芐的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日吸取1mL的過夜培養(yǎng)菌液接種于50mL新鮮培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～0.7，加IPTG至終濃度為1.0mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)，并設(shè)IPTG未誘導(dǎo)為對(duì)照。離心分別收集培養(yǎng)2、4、6、8h的菌體，經(jīng)PBS緩沖液洗滌兩次后，再用PBS緩沖液溶解、等體積的2×SDS懸浮，100℃水浴5min，SDS -PAGE電泳分析。

1.7.7 融合蛋白的純化

將含有pGEX-4T-1-Ara h 2的重組質(zhì)粒的菌液，誘導(dǎo)表達(dá)2h后，收集菌液。離心、洗滌沉淀。用PBS緩沖液溶解菌體，加入蛋白酶抑制劑Cocktail片劑，混勻。用超聲波破碎細(xì)胞，超聲條件為：功率300W，超聲3s、間隔3s，共60次。樣品經(jīng)超聲后4℃、10000r/min離心15min。取出上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，在相同條件下再次離心30min，取上清。將所得上清采用Glutathione Sepharose 4B凝膠親和層析純化，方法按Amersham公司操作手冊(cè)進(jìn)行。并取純化產(chǎn)物5μL，加等體積的2×SDS懸浮，100℃水浴5min，SDS-PAGE電泳分析。

1.7.8 融合蛋白的免疫印跡

將純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，條件為：恒流40mA，1h；然后將膜取出，用5%的脫脂乳封阻，37℃溫育1h；用TBST洗滌3次，每次洗滌10min，加入1:3000稀釋的兔抗Ara h 2血清將膜浸沒，37℃溫育1h；洗滌(方法如前述)；加入1:5000稀釋的HRP酶標(biāo)羊抗兔IgG二抗，37℃溫育1h；洗滌(方法如前述)；最后加入4-氯-1-萘酚顯色5min即可。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ara h 2 cDNA片段的擴(kuò)增

圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoretic pattern of the RT-PCR products of peanut Ara h 2 cDNA fragment

以總RNA為基因來源，通過RT-PCR擴(kuò)增Ara h 2 cDNA片段，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示，在約500bp處有特異性條帶，其大小與預(yù)計(jì)的Ara h 2相符合，可以初步確定為Ara h 2 cDNA片段。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Agarose gel electrophoretic patterns of pMD19-T-Ara h 2 before and after digestion with EcoR I and Not I

將重組質(zhì)粒pMD19-T-Ara h 2分別經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示。酶切所得的小片段約為500bp，與目的基因片段大小相符，另一片段為載體大小，初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 Ara h 2基因的測(cè)序及序列分析

將測(cè)序結(jié)果用Blast工具分析其同源性，結(jié)果表明，克隆的基因序列與已經(jīng)公布的Ara h 2.02基因序列同源性達(dá)到100%。由此可證明已經(jīng)成功克隆到正確的Ara h 2.02基因序列。

2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖3 pGEX-4T-1-Ara h 2的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoretic patterns of pGEX-4T-1-Ara h 2 before and after digestion with EcoR I and Not I

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Ara h 2，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一約500bp大小的酶切片段，與目的基因片段大小相符，另一片段為表達(dá)載體大小。測(cè)序結(jié)果表明，目的基因Ara h 2.02的編碼基因正確的融合到表達(dá)載體上，方向正確，無任何其他的外基因插入，可以確認(rèn)構(gòu)建成功。

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

圖4 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Ara h 2在BL21(DE3)RIPL中經(jīng)不同時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的電泳圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of the bacterial lysates of BL21(DE3)RIPL harboring pGEX-4T-1-Ara h 2 induced with IPTG for different times

含pGEX-4T-1-Ara h 2重組質(zhì)粒的BL21(DE3)RIPL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在約46kD處有明顯的蛋白條帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的陽性菌在此位置未見有目標(biāo)蛋白。載體pGEX-4T-1所帶的標(biāo)簽蛋白GST分子質(zhì)量約為26kD，加上Ara h 2蛋白的分子質(zhì)量，所表達(dá)的融合蛋白分子質(zhì)量應(yīng)為46kD?？梢?，融合蛋白分子質(zhì)量與理論值相符。蛋白經(jīng)不同時(shí)間誘導(dǎo)，其表達(dá)量也有所不同。通過Quantity One凝膠成像系統(tǒng)軟件分析結(jié)果顯示，融合蛋白經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)2h后，其蛋白含量占總蛋白量的22.5%。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間增加，其蛋白含量略有減少，且隨著時(shí)間的不斷增加蛋白含量也在不斷降低。

2.6 GST-Ara h 2融合蛋白的純化

圖5 目標(biāo)蛋白的純化電泳圖Fig.5 SDS-PAGE analysis of GST-Ara h 2 fusion protein purified from the bacterial lysates of BL21(DE3)RIPL harboring pGEX-4T-1-Ara h 2 after 24 h IPTG induction

超聲破碎細(xì)胞后，上清液通過Glutathione Sepharose 4B親和純化，結(jié)果如圖5所示。通過Quantity One凝膠成像系統(tǒng)軟件分析其純度約為90%，且每1000mL培養(yǎng)菌可獲得0.1mg左右的重組蛋白。

2.7 GST-Ara h 2融合蛋白的免疫印跡結(jié)果

圖6 融合蛋白的免疫印跡分析Fig.6 Western blotting analysis of the specific reaction of GST-Ara h 2 fusion protein with the anti-Ara h 2 sera from rabbits

純化的融合蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)膜后，與兔抗Ara h 2血清反應(yīng)，在目標(biāo)蛋白處有明顯特異性印跡，而與兔陰性血清反應(yīng)無任何印跡出現(xiàn)，如圖6所示。該結(jié)果表明該重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)原性。

3 討 論

對(duì)于大多數(shù)E.coli，密碼子AGG/AGA(arginine)、AUA(isoleucine)、CUA(leucine)、CGA(arginine)及 CCC(proline)使用率最低，被稱之為稀有密碼子。當(dāng)帶有上述密碼子的外源基因mRNA在E.coli中表達(dá)，可能會(huì)導(dǎo)致翻譯終止或錯(cuò)誤[8-10]。目的基因Ara h 2.02中含有大量的AGG/AGA稀有密碼子，其含量接近整個(gè)編碼基因的10%。因此，為有效表達(dá)該目的基因，選擇了添加了稀有密碼子的大腸桿菌BL21(DE3)codonPlus-RIPL作為表達(dá)宿主菌。研究結(jié)果表明，選擇的載體和宿主菌可以表達(dá)出Ara h 2，與理論分析一致。實(shí)際上相似的結(jié)果也被Lehmann等[11]證實(shí)，他們通過將克隆的Ara h 2基因與表達(dá)載體pET32a連接，并引入帶有編碼大腸桿菌精氨酸稀有密碼子AGG/AGA的tRNA基因pUBS520質(zhì)粒，最后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌E.coli Origami(DE3)中，也實(shí)現(xiàn)了Ara h 2蛋白的表達(dá)。

本研究利用基因重組技術(shù)克隆了Ara h 2.02基因，通過原核系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了體外有效表達(dá)，并采用親和純化獲得了高純度的Ara h 2融合蛋白。實(shí)驗(yàn)中選擇pGEX表達(dá)載體，因純化條件溫和，整個(gè)過程無變性劑的加入，可最大限度地保持了蛋白的天然構(gòu)象和活性。另外，由于GST標(biāo)簽與目的蛋白之間設(shè)計(jì)了凝血酶(或Xa因子)的識(shí)別切割位點(diǎn)，使得純化后的融合蛋白即可將GST切下、去除，從而可得到無標(biāo)簽的高純度目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)得到了純度較高的融合蛋白Ara h 2，但電泳結(jié)果顯示在目的蛋白下方位置還有個(gè)別條帶出現(xiàn)，這可能是因目的蛋白發(fā)生部分降解而導(dǎo)致，可通過實(shí)驗(yàn)過程中盡量保持低溫操作及加入適量的蛋白酶抑制劑來改善。但由于目的蛋白大多數(shù)以包涵體的形式存在，使得所得的純化蛋白量很有限，可通過優(yōu)化表達(dá)條件來盡可能的提高可溶性蛋白含量，或通過將包涵體變性復(fù)性的途徑來獲取更多目標(biāo)蛋白。目的蛋白免疫印跡結(jié)果表明了該重組蛋白具有很好的免疫原性，可用于今后的相關(guān)研究。

此外，通過基因工程的手段生產(chǎn)重組蛋白是制備食物過敏原的重要途徑。重組食物過敏原不僅可以大量生產(chǎn)且具有高純度、品質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，甚至可替代天然提取物用于靈敏性更高、特異性更強(qiáng)的食物過敏原的檢測(cè)[12]。大量文獻(xiàn)表明，重組食物過敏原在食物過敏原的檢測(cè)以及食物過敏的診斷與治療等方面都顯示了重要的價(jià)值，是天然過敏原的最佳替代物[13-14]。由于不同的表達(dá)體系對(duì)不同的外源基因會(huì)產(chǎn)生異樣的表達(dá)效果，加之Ara h 2編碼基因中含有大量的AGG/AGA稀有密碼子。因此，本研究工作只是一個(gè)初步探索，Ara h 2重組蛋白的原核表達(dá)體系，優(yōu)化條件還值得進(jìn)一步研究，甚至可以開展Ara h 2重組蛋白的真核表達(dá)工作。

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Preliminary Investigation on the Biosynthesis of Recombinant Peanut Allergen Ara h 2

HU Chun-qiu1,2，GAO Jin-yan1,3，LUO Chun-ping1,2，CHEN Hong-bing1,2,*，ZHU Pan1,2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. School of Life Sciences and Food Engineering,Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Q786

A

1002-6630(2010)15-0203-05

2010-05-07

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-200807)；

江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)項(xiàng)目([2004]234號(hào))；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(NCET-08-07-04)

胡純秋(1980—)，女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：hchqiu@yahoo.com.cn

*通信作者：陳紅兵(1967—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：chbgjy@hotmail.com