林 琳，張 可，錢 和

(1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海 200233；2.空軍航空醫(yī)學(xué)研究所，北京 100000；3.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

輻照雞肉鄰位酪氨酸含量檢測方法的研究

林 琳1，張 可2，錢 和3,*

(1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海 200233；2.空軍航空醫(yī)學(xué)研究所，北京 100000；3.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

建立輻照雞肉中鄰位酪氨酸含量的高效液相色譜檢測方法。輻照雞肉中的鄰位酪氨酸經(jīng)105℃，6mmol/L鹽酸溶液水解4h以上，C18固相萃取柱凈化，5%乙腈溶液分3次洗脫目標(biāo)物，在激發(fā)波長275nm，發(fā)射波長305nm，98% 0.2mol/L NaH2PO4水溶液和2%乙腈作為流動相的條件下，用熒光檢測器進行檢測。研究表明，檢出限為0.1mg/kg，加標(biāo)水平在1.0mg/kg時，回收率為97.3%。輻照劑量在10～100kGy的范圍內(nèi)，輻照雞肉中鄰位酪氨酸含量與輻照劑量呈線性關(guān)系。

鄰位酪氨酸；高效液相色譜法；輻照雞肉

Abstract ：A method using HPLC with fluorescence detection was developed for the determination of o-tyrosine in irradiated chicken products. Samples were hydrolyzed with 6 mmol/L HCl at 105 ℃ for 4 h in a vacuum environment and cleaned up on a C18solid-phase extraction column. Three-time elution of the column with 5% actonitrile in water was carried out for the desorption of o-tyrosine. The excitation and emission wavelengths for fluorescence detection were set at 275 nm and 305 nm, respectively.The method exhibited a limit of detection of 0.1 mg/kg. The average spike recovery (6 replicates) for o-tyrosine at 1.0 mg/kg was 97.3%. Over the range of 10 to 100 kGy, irradiation dose displayed good linearity with o-tyrosine content of irritated chicken meat.

Key words：o-tyrosine；HPLC method；irritated chicken meat

輻照食品的定義是指利用放射性60Co 或137Cs 發(fā)出的γ射線或利用電子加速器產(chǎn)生的電子束(最大能量10MeV) 或X射線(最大能量5MeV) 在一定的劑量范圍內(nèi)處理而達(dá)到滅菌保鮮的食品。通過輻照工藝處理的食品營養(yǎng)損失小，不改變食品原有色香味形，衛(wèi)生安全，保鮮期較長，既可避免藥物保鮮帶來的物質(zhì)殘留，又可以殺滅食品中的害蟲，消除食品中病原微生物及其他腐敗細(xì)菌，抑制食品(如水果、蔬菜等活機體) 的生理生化過程(發(fā)芽和成熟)，從而達(dá)到食品保藏或保鮮的目的[1]。

在輻照食品檢測方面，歐盟現(xiàn)已頒布碳?xì)浠衔锏臍庀嗌V(GC) 分析法、2-烷基環(huán)丁酮的GC/MS 分析法、骨骼及纖維素的電子自旋共振( ESR) 譜法和硅酸鹽礦物的熱釋光法、結(jié)晶糖的ESR 譜法、光致發(fā)光法、直接表面熒光過濾技術(shù)/富氧板計數(shù)的微生物篩選法[2]、DNA彗星篩選法等輻照食品檢測的多種標(biāo)準(zhǔn)方法[3-4]。但由于輻照食品種類的復(fù)雜性和技術(shù)的局限性，沒有一種技術(shù)有可能用于所有食品物料，如含脂食品的碳水化合物需要采用2-烷基環(huán)丁酮法檢測，含骨食品需要采用電子自旋共振法檢測，含硅礦物質(zhì)食品或農(nóng)產(chǎn)品需要采用熱輝光檢測。我國有關(guān)輻照食品的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)不足，尚未完善，已經(jīng)制訂的標(biāo)準(zhǔn)、法規(guī)、規(guī)程等也未與國際接軌，各國對食品輻照問題仍存在許多技術(shù)和認(rèn)識上的差異，尤其是缺乏系統(tǒng)可行的輻照食品檢測方法，嚴(yán)重影響了輻照食品的國際貿(mào)易。

本實驗利用高效液相色譜檢測法(HPLC)，通過檢測輻照后肉制品中鄰位酪氨酸含量的變化來判別肉制品是否經(jīng)過輻照。鄰位酪氨酸即DL-o-tyrosine，是L-酪氨酸的同分異構(gòu)體，它與L-酪氨酸在結(jié)構(gòu)上的差異主要在苯環(huán)上的羥基，即L-型酪氨酸在對位p-，而鄰位酪氨酸在鄰位o-上。應(yīng)用輻解產(chǎn)物檢測輻照蛋白質(zhì)食品已經(jīng)進行了許多研究，其中苯丙氨酸或含苯丙氨酸的蛋白質(zhì)食品輻照產(chǎn)生的羥基化產(chǎn)物——鄰位酪氨酸和間位酪氨酸更富應(yīng)用潛力。因此在食品中這些產(chǎn)物的存在可被看作是食品已被輻照的標(biāo)志。輻照生成的酪氨酸異構(gòu)體中，鄰酪氨酸的量最大，利用色譜技術(shù)可將其與天然的對酪氨酸分離，因此選用鄰酪氨酸作為檢測蛋白質(zhì)食品輻照的探針化合物[5-8]。大多數(shù)氨基酸在紫外可見光區(qū)無吸收，必須將其衍生、轉(zhuǎn)化為具有紫外可見吸收或能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)才能檢測，但是酪氨酸例外。大多數(shù)情況下，由于吸收輻射能而被提升到激發(fā)電子態(tài)的分子都是通過激發(fā)能的非輻射轉(zhuǎn)移給周圍的分子回復(fù)到基態(tài)，能量以熱的形式散失，但也有分子將再輻射，從而產(chǎn)生熒光[9-11]。酪氨酸殘基是蛋白質(zhì)中最主要的內(nèi)源熒光基團之一，其結(jié)構(gòu)上的酚羥基是強的給電子基團，是能夠加強熒光量子產(chǎn)生的基團，通常不需要衍生基團的協(xié)助即可產(chǎn)生熒光，而鄰位酪氨酸由于酚羥基從對位轉(zhuǎn)移到鄰位，此時鄰位取代基的空間效應(yīng)大于間位和對位取代基的重原子效應(yīng)和吸電子誘導(dǎo)效應(yīng)，起著主導(dǎo)作用，不僅加強了鄰位酪氨酸的熒光量子產(chǎn)生率而且使化合物的熒光壽命比酪氨酸更長。因此本實驗嘗試建立非衍生的樣品處理方法來檢測雞肉中的鄰位酪氨酸含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

雞肉 上海出入境檢驗檢疫局。

鄰位酪氨酸(標(biāo)準(zhǔn)品)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、磷酸二氫鈉(色譜純)、鹽酸(分析純)。

Agilent 1100液相色譜儀 美國Agilent公司；T25basic ULTRA-TURRAX高速搗碎機；LABOROTA4003 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；固相萃取系統(tǒng) 美國Supelco 公司。

1.2 樣品的處理

將輻照和未經(jīng)輻照的雞肉樣品去皮、去骨，并小心去除黏附在肌肉上的脂肪，取雞腿部分，在組織攪碎機中攪碎均勻，稱取0.2～0.5g(精確到0.001g)樣品于試管中，加入6mmol/L鹽酸5.0mL，抽真空后密封105℃水解4h。水解液經(jīng)濾紙粗過濾后取1mL經(jīng)C18固相萃取柱凈化，C18固相萃取柱預(yù)先用甲醇和水活化，用5%乙腈溶液分3次洗脫目標(biāo)物，并定容至5.0mL。以下實驗均以冷凍雞肉為代表。

1.3 鄰位酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的配制

稱取0.01g(精確到0.0001g)標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中，用流動相定容(流動相組成詳見儀器條件)，此溶液鄰位酪氨酸含量為100mg/L，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋100倍后作為標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)工作液中鄰位酪氨酸的含量為1.0mg/L，工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 儀器條件

色譜柱：C18反相色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長275nm，發(fā)射波長305nm；流動相：98% 0.2mol/L NaH2PO4溶液和2%乙腈；流速：1.0mL/min；進樣量：20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限

2.1.1 基線噪音

在所需的儀器條件下，儀器平衡1h后，測得儀器的噪音為h噪音=0.023mAU。

2.1.2 檢出限

當(dāng)響應(yīng)信號應(yīng)為噪音的3倍時所需的樣品量即為最低檢出限。質(zhì)量濃度為0.1μg/mL標(biāo)樣在相同條件下進樣6次，按檢出限的定義分析數(shù)據(jù)可得本方法對鄰位酪氨酸的檢出限為0.1mg/kg。

2.2 樣品水解條件的優(yōu)化

2.2.1 最適水解時間

表1 105℃不同水解時間對回收率的影響Table 1 Effect of length of acidic hydrolysis on o-tyrosine recovery in irritated and unirritated chicken meat

輻照雞肉樣品的水解溫度通常為105℃。實驗中發(fā)現(xiàn)，在此條件下水解1h，輻照雞肉樣品未檢出鄰位酪氨酸，而由表1可知，水解4h或以上均可以達(dá)到消化完全，且目標(biāo)物無明顯損失，因此105℃下的最適水解時間為4h。

2.2.2 水解液凈化濃縮條件

2.2.2.1 水解液未濃縮

圖1 未經(jīng)濃縮的樣品譜圖Fig.1 Chromatogram of the unconcentrated sample hydrolysate

將水解液經(jīng)濾紙粗過濾后取1mL經(jīng)C18固相萃取柱凈化，C18固相萃取柱預(yù)先用甲醇和水活化。用5%乙腈溶液分3次洗脫目標(biāo)物，并定容至5mL后直接進樣。結(jié)果回收率可達(dá)85%以上，但是陽性樣品目標(biāo)物響應(yīng)面積較小(圖 1)。

2.2.2.2 水解液經(jīng)固相萃取柱凈化后濃縮

圖2 濃縮后樣品譜圖Fig.2 Chromatogram of the concentrated sample hydrolysate

將水解液經(jīng)濾紙粗過濾后取1mL經(jīng)C18固相萃取柱凈化，用5%乙腈的水溶液分3次洗脫目標(biāo)物，合并洗脫液并用氮氣吹干至1mL后進樣?；厥章释瑯涌蛇_(dá)85%以上，但陽性樣品目標(biāo)物響應(yīng)面積明顯增加(圖2)。說明實驗中采用濃縮步驟更易于檢測以及目標(biāo)物的分離。

2.3 固相萃取柱條件

2.3.1 固相萃取柱種類的選擇

表2 不同固相萃取柱的選擇Table 2 Recovery of o-tyrosine in irritated and unirritated chicken meat extracted with different solid-phase extraction columns

實驗過程中，使用的未輻照雞肉中鄰位酪氨酸含量小于0.1mg/kg，輻照劑量為10kGy的雞肉中鄰位酪氨酸含量即雞肉樣品的本底值為1.67mg/kg，加標(biāo)量為20mg/kg。由表2可知，采用C18固相萃取柱進行萃取凈化較適宜。

2.3.2 洗脫體積的確定

稱取0.5g未輻照雞肉(精確到0.001g)樣品于試管中，并加入標(biāo)樣10μg，按1.2節(jié)的方法處理，取1mL過C18柱，測定不同洗脫體積下的回收率，如表3所示。

表3 不同洗脫體積對回收率的影響Table 3 Effect of amount of the elution solvent on o-tyrosinerecovery

由表3可知，當(dāng)洗脫體積達(dá)到5mL時，加標(biāo)回收率為89.3%，說明目標(biāo)物收集基本完全，故本實驗中采用的洗脫體積為5mL。

2.4 鹽酸濃度對酪氨酸含量的影響

稱取輻照后的雞肉樣品0.2g左右(精確到0.001g)，在采用不同濃度鹽酸水解的條件下分別進行回收率實驗，比較用不同濃度的鹽酸進行水解對輻照雞肉中鄰位酪氨酸含量的影響。其中各輻照雞肉樣品中加入質(zhì)量濃度為0.1μg/μL的標(biāo)樣5μL，即加標(biāo)量為0.5μg，樣品定容體積為5.0mL。按1.2節(jié)方法操作，結(jié)果見表4。由表4可知，當(dāng)鹽酸濃度為6.0mmol/L時，樣品檢出值較高，加標(biāo)回收率也最好。

表4 鹽酸濃度對回收率的影響Table 4 Effect of HCl concentration on o-tyrosine recovery

2.5 加標(biāo)回收率

移取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到樣品中，使加標(biāo)量控制在1.0mg/kg樣品。充分混合均勻后，經(jīng)提取后定容到1.0mL；再經(jīng)0.45μm有機膜過濾后直接注入液相色譜儀，記錄色譜圖。實驗結(jié)果總結(jié)于表5。

表5 方法回收率Table 5 Average spike recovery (6 replicates) for o-tyrosine at 1.0 mg/kg

2.6 鄰位酪氨酸含量與輻照劑量的關(guān)系

表6 雞肉中輻照劑量和鄰位酪氨酸含量的關(guān)系Table 6 Relationship between irradiation dose and o-tyrosine content of irritated chicken meat

由表6可知，當(dāng)輻照劑量在10～100kGy的范圍內(nèi)，輻照劑量與鄰位酪氨酸的含量呈線性關(guān)系，因而可以依據(jù)鄰位酪氨酸的含量來間接推測雞肉被輻照的劑量。

3 結(jié) 論

輻照雞肉中的鄰位酪氨酸在105℃，6mmol/L鹽酸水解4h以上，C18固相萃取柱凈化5%乙腈溶液分3次洗脫目標(biāo)物，經(jīng)高效液相色譜熒光檢測器檢測的方法，可以滿足實驗要求，且在10～100kGy輻照劑量內(nèi)輻照劑量與鄰位酪氨酸的含量呈線性關(guān)系。

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HPLC Determination of o-Tyrosine in Irradiated Chicken Products

LIN Lin1，ZHANG Ke2，QIAN He3,*
(1. Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research, Shanghai 200233, China；2. Airman Aeromedicine Institution,Beijing 100000, China；3. State Key Laborary of Food Science and Technology, Jiangnan University , Wuxi 214122, China)

TS207

A

1002-6630(2010)10-0188-04

2009-05-21

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2008BAD91B04-1)；教育部創(chuàng)新團隊基金項目(PCSIRT0627)；

教育部創(chuàng)新引智計劃項目(111-project-B07029)

林琳(1978—)，女，工程師，碩士，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：linliniris@hotmail.com

*通信作者：錢和(1962—)，女，教授，博士，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：amtf168@126.com