李小芳,馮小強(qiáng),伏國(guó)慶,楊 聲＊,蘇中興

1天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院;2天水市中醫(yī)醫(yī)院化驗(yàn)科,天水 741001;3蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,蘭州 730000

殼聚糖中胺基對(duì)其抑菌性能的影響及與DNA的作用

李小芳1,馮小強(qiáng)1,伏國(guó)慶2,楊 聲1＊,蘇中興3

1天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院;2天水市中醫(yī)醫(yī)院化驗(yàn)科,天水 741001;3蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,蘭州 730000

采用抑菌圈法研究了殼聚糖對(duì)大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌 (St.aureus)的抑菌活性。利用殼聚糖的席夫堿反應(yīng),對(duì)殼聚糖的胺基進(jìn)行保護(hù)后,研究了殼聚糖中胺基對(duì)其抑菌性能的影響。同時(shí),運(yùn)用紫外吸收光譜和電化學(xué)的方法,研究了殼聚糖與 DNA的相互作用,提出了殼聚糖對(duì)E.coli和St.aureus的抑菌機(jī)理。研究結(jié)果表明,殼聚糖對(duì)E.coli和St.aureus具有很好的抑制作用,且抑菌活性與其胺基有關(guān);殼聚糖能與細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電的核酸結(jié)合,使細(xì)胞正常DNA復(fù)制生理功能受到影響,抑制細(xì)菌的繁殖,從而達(dá)到抑菌的目的。

殼聚糖;抑菌活性;希夫堿;胺基;DNA

殼聚糖(Chitosan,簡(jiǎn)稱(chēng) CTS)是甲殼素脫乙酰的產(chǎn)物,來(lái)源豐富、無(wú)毒,是可吸收降解的直鏈狀高分子化合物。殼聚糖及其衍生物具有廣譜的抗菌性能,可抑制多種細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)[1-5]。但是,就其確切的抑菌機(jī)理目前尚不清楚。Young等認(rèn)為殼聚糖可吸附于細(xì)菌表面,與細(xì)菌細(xì)胞膜作用而改變其通透性[6];Helander等提出,殼聚糖對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌作用是由于細(xì)胞外膜被破壞,最終造成菌體死亡[7];Hadwiger提出以細(xì)菌分子中DNA為作用靶向的抗菌機(jī)理[8];Tokura等認(rèn)為殼聚糖吸附細(xì)菌后,殼聚糖分子包埋了整個(gè)細(xì)胞,抑制了細(xì)菌的呼吸和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[9];Papineu等研究認(rèn)為殼聚糖的抑菌作用可能是由于它導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏而引起的[10]。普遍認(rèn)為殼聚糖的抑菌機(jī)理存在以下幾種可能:(1)殼聚糖干擾菌體細(xì)胞膜的功能,從而達(dá)到抑菌的效果;(2)殼聚糖直接與菌體的DNA和mRNA作用;(3)殼聚糖激活幾丁質(zhì)酶,達(dá)到抑菌的目的;(4)殼聚糖中的胺基在起抑菌作用;(5)殼聚糖與細(xì)胞質(zhì)發(fā)生作用。其中殼聚糖對(duì)細(xì)菌 DNA的作用是基于其抗菌機(jī)理研究的推論。有一種推論認(rèn)為帶有正電的低分子量殼聚糖進(jìn)入到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部,與帶有負(fù)電的DNA作用,干擾其復(fù)制,或阻礙mRNA的合成。劉曉非等用激光共焦顯微鏡對(duì)異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記的低分子量殼聚糖 (Mw≤8000)與大腸桿菌作用的觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)具有抗菌性的殼聚糖齊聚物進(jìn)入到了細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)部[11]。

一般認(rèn)為殼聚糖的抑菌性能主要由-NH2引起的。利用殼聚糖上的胺基與醛 (或酮)發(fā)生反應(yīng)生成相應(yīng)的醛 (或酮)亞胺化衍生物[12,13],對(duì)胺基進(jìn)行了保護(hù)后,研究了殼聚糖中的胺基對(duì)殼聚糖抑菌性能的影響。運(yùn)用紫外吸收光譜和電化學(xué)分析的方法,研究了殼聚糖與 DNA的相互作用,初步提出了殼聚糖對(duì)E.coli和St.aureus的抑菌機(jī)理。該研究為殼聚糖的臨床應(yīng)用提供更加充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù),并擴(kuò)大了殼聚糖在醫(yī)藥和食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

大腸桿菌 (E.coli,ATCC 35218),金黃色葡萄球菌 (St.aureus,ATCC 26113)。相對(duì)分子量 50,000的殼聚糖 (浙江玉環(huán)殼聚糖有限公司,DD.98%), DNA(美國(guó) Sigma公司),其純度通過(guò)比較 260與280 nm處吸光度來(lái)確定 (A260/A280=1.87)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[14]。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液由NaH2PO4-Na2HPO4配制;試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水,電化學(xué)實(shí)驗(yàn)均在室溫條件下通氮?dú)?10 min后進(jìn)行。

UV-9200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (北京瑞利分析儀器公司);Spectrum One FT-I R(Perkin Elmer); TG-TDA(Pyris Diamond TG/DTA);EC-12B型多功能微機(jī)電化學(xué)分析儀 (江蘇江分電分析儀器公司),三電極系統(tǒng) (工作電極:金電極,輔助電極:鉑絲電極,參比電極:Ag-AgCl電極)。

1.2 抑菌圈法測(cè)定殼聚糖的抑菌活性[15]

抑菌圈法是將含有定量抗生素的濾紙片貼在已接種了測(cè)試菌的瓊脂表面上,紙片中的藥物在瓊脂中擴(kuò)散,隨著擴(kuò)散距離的增加抗生素的濃度呈對(duì)數(shù)減少,在藥物濃度到達(dá)的范圍內(nèi)對(duì)此藥敏感的細(xì)菌不能生長(zhǎng)而形成透明的抑菌圈,不同細(xì)菌形成的抑菌圈各不相同,抑菌圈的大小反映了測(cè)試菌對(duì)該藥的敏感程度。如果抑菌劑能殺死或抑制皿中供試菌的生長(zhǎng),則在濾紙片的周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)一個(gè)無(wú)菌生長(zhǎng)的透明圈,即抑菌圈。以抑菌圈的直徑作為評(píng)定指標(biāo),抑菌圈直徑越大,說(shuō)明該抑菌劑對(duì)此種供試菌的抑制效果越好,反之則抑制效果越差將受試菌種接種于固體瓊脂培養(yǎng)基,37℃活化E.coli24 h,St.aureus活化48 h。將活化后的受試菌種用接種環(huán)挑取菌苔于生理鹽水中,制成 O.D630(E.coli)=0.745;O.D 630(St.aureus)=0.624的菌懸液備用。取直徑 6 mm已滅菌的圓濾紙片放入濃度分別為 5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL的殼聚糖溶液(溶于 1.0% HAc)中浸泡。將 0.1 mL菌懸液涂布在培養(yǎng)基平板上,用無(wú)菌鑷子取浸泡過(guò)的圓濾紙片貼于培養(yǎng)皿中,每皿貼 5片。以 1.0%的 HAc溶液作為空白對(duì)照。37℃恒溫培養(yǎng) 48 h,測(cè)定圓濾紙片的抑菌圈直徑。

1.3 殼聚糖席夫堿的制備

一定量殼聚糖溶于 20 mL 3.0%HAc攪拌溶脹30 min,加 20 mL無(wú)水乙醇稀釋,轉(zhuǎn)入 100 mL圓底燒瓶中,將用 10 mL乙醇分別稀釋的醛 (甲醛、苯甲醛、呋喃甲醛、正丁醛)滴入(η-NH2:η-CHO=1:6),水浴加熱控制溫度 (80℃),回流 5 h。反應(yīng)快結(jié)束時(shí),調(diào) pH到 9～10,抽濾,沉淀用 20 mL無(wú)水乙醇和乙醚反復(fù)洗滌除過(guò)量的醛,烘干后繼續(xù)在索氏萃取器中用 95%乙醇回流 8 h,恒溫干燥分別得到的殼聚糖席夫堿衍生物。

圖 1 希夫堿反應(yīng)方程式Fig.1 The synthesis of Schiff’s base

1.4 殼聚糖席夫堿的表征

1.4.1 紅外吸收光譜測(cè)定

采用 KBr壓片法,Spectrum One傅立葉紅外光譜儀 (Perkin E lmere)測(cè)量殼聚糖及席夫堿的紅外吸收光譜,測(cè)量波長(zhǎng)數(shù)為 400～4000 cm-1。

1.4.2熱重-差熱(TG-DTA)分析

采用 Perkin Elmere TG-DTA分析儀 (Pyris Diamond Analyzer),以α-Al2O3為參比,升溫速率 10℃/min,對(duì)殼聚糖及席夫堿熱力學(xué)分析。

1.5 席夫堿抑菌活性分析

稱(chēng)取殼聚糖及其希夫堿各 50 mg研磨成粉末,溶于 10 mL 1.0%的 HAc溶液中,配成濃度為 5 mg/ mL的溶液待用。含有15 mL液體培養(yǎng)基和4 mL殼聚糖或席夫堿的試管滅菌后,分別加入 1 mL的E. coli(OD600nm=0.473)或St.aureus(OD600nm= 0.435),使殼聚糖及席夫堿最終濃度為 1 mg/mL;用4 mL 1.0%的 HAc溶液作為空白對(duì)照。37℃搖床培養(yǎng),分光光度計(jì)下測(cè)定不同時(shí)間內(nèi)O.D610 nm。

1.6 殼聚糖與DNA相互作用紫外吸收光譜

在 1 cm×1 cm石英比色管中加入一定量的Tris-HCl緩沖液、2μL的DNA溶液和 80μL 1%已在 121℃滅菌了 15 min的殼聚糖溶液,用二次蒸餾水稀釋至刻度,以不含DNA的 Tris-HCl緩沖液為試劑空白,于 200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定DNA與殼聚糖相互作用后的紫外吸收光譜。

1.7 殼聚糖與DNA相互作用的電化學(xué)研究

金電極分別用金相砂紙和在麂皮上用 0.5μm和 0.3μm的α-Al2O3研磨液研磨,再用二次蒸餾水、乙醇、丙酮超聲清洗各 5 min,然后浸入新配制的Piranha(VH2SO4∶VH2O2(30%)=7∶3)溶液中 10 min,用二次蒸餾水和乙醇超聲清洗干凈,氮?dú)獯蹈杉纯?。?0.1 mol/L的空白NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH=6.5)為支持電解質(zhì)。先將三電極體系放入空白緩沖液中,在-0.2～1.5 V電位范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描至電流穩(wěn)定為止。處理好的金電極其表面干燥后,滴加 20μL 1.0 mg/mL的 DNA溶液,置于冰箱中干燥 6 h以上。采用傳統(tǒng)的三電極體系,以修飾電極為工作電極,鉑片電極為對(duì)電極,Ag-AgCl電極為參比電極,掃描范圍為-0.2～1.5 V(所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行)。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖對(duì)E.coli和St.aureus的抑菌活性

不同濃度殼聚糖對(duì)E.coli和St.aureus對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑如圖 2,3所示?？梢钥闯?殼聚糖作用E.coli和St.aureus后,均具有明顯的抑菌圈,且隨著殼聚糖濃度的增加,與對(duì)照組相比抑菌圈的直徑逐漸增加,說(shuō)明殼聚糖對(duì)E.coli和St.aureus的生長(zhǎng)有較好的抑制作用。

2.2 殼聚糖席夫堿衍生物的表征

2.2.1 紅外光譜

圖 4是殼聚糖、殼聚糖-Ⅰ、殼聚糖-Ⅱ、殼聚糖-Ⅲ、殼聚糖-Ⅳ的 FT-IR圖。其中,3441.0 cm-1處是殼聚糖形成氫鍵締合的-OH伸縮振動(dòng)吸收峰與-NH2的伸縮振動(dòng)吸收峰重疊而增寬的多重吸收峰, 1599.4 cm-1處是氨基的 N-H特征吸收峰,1651 cm-1處是酰胺吸收峰。殼聚糖席夫堿在 1599.4 cm-1的N-H特征吸收峰消失,這說(shuō)明-NH2已經(jīng)得到了保護(hù);1638 cm-1附近的吸收峰歸屬 C=N伸縮振動(dòng),證明-NH2和-CHO基團(tuán)發(fā)生了反應(yīng)。

圖 4 殼聚糖、殼聚糖-Ⅰ、殼聚糖-Ⅱ、殼聚糖-Ⅲ和殼聚糖-Ⅳ的紅外光譜Fig.4 I R spectra of chitosan and Schiff’s base

2.2.2 熱重分析

殼聚糖和其席夫堿的 TG如表 2所示。殼聚糖的降解分為三個(gè)階段[16]:第一個(gè)階段在 80℃開(kāi)始,失重 10%,主要是失去水分子;第二個(gè)階段失重在250℃開(kāi)始,到 500℃失重達(dá)最大,失重 55%;最終分解溫度為 688℃。四種殼聚糖席夫堿衍生物主鏈斷裂的溫度明顯低于殼聚糖主鏈斷裂的溫度,這表明殼聚糖的席夫堿衍生物與殼聚糖相比不穩(wěn)定,它們的不穩(wěn)定性是由于缺少自由的氨基,在制備衍生物時(shí)氨基被醛取代,殼聚糖因其有自由的氨基而更穩(wěn)定[17]。

表 1 殼聚糖和席夫堿的 TG數(shù)據(jù)Table 1 Thermograv imetry analysis of chitosan and schiff’s bases

2.3 殼聚糖及席夫堿對(duì)E.coli和St.aureus抑菌活性

圖 5是殼聚糖及席夫堿衍生物作用E.coli和St.aureus后不同時(shí)間內(nèi) O.D610nm的變化?？梢钥闯鰵ぞ厶窍驂A的 O.D610nm均高于殼聚糖,和對(duì)照組的O.D610nm相差不大,說(shuō)明改性的殼聚糖抑菌活性大大降低。并且發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng),苯甲醛與殼聚糖的席夫堿對(duì)E.coli有微弱的抑制作用,這可能是結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)的緣故。席夫堿改性后的殼聚糖幾乎失去了抑菌的功能,同時(shí)也說(shuō)明殼聚糖對(duì)E.coli和St.aureus的抑制作用主要與-NH2的質(zhì)子化有關(guān)。

圖 5 殼聚糖及希夫堿作用E.coli(a)和St.aureus(b)后的 O.D610nmFig.5 O.D610nmof different Chitosan Schiff bases toE.coliandSt.aureus

2.4 紫外光譜研究殼聚糖與DNA相互作用

由于核酸分子本身有光吸收活性,許多外來(lái)分子與核酸結(jié)合后,對(duì)核酸或外來(lái)分子的吸收都有影響。紫外-可見(jiàn)吸收光譜法是研究外來(lái)分子與核酸相互作用機(jī)理的最常用、最方便的方法。含有芳香性和磷酸生色基團(tuán)雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA分子,其UV-vis吸收光譜在 260 nm附件有一強(qiáng)的吸收峰,某些小分子亦有吸收譜帶,可根據(jù)相互作用前后DNA或其他分子的吸收譜帶的變化對(duì)二者相互作用模式進(jìn)行判斷。增色、減色效應(yīng)是DNA特有的與其雙螺旋結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的光譜性質(zhì)。對(duì) DNA的吸收光譜來(lái)說(shuō),如果導(dǎo)致分子的軸向變化即其構(gòu)象變化,則產(chǎn)生減色效應(yīng)及紅移現(xiàn)象,且作用越強(qiáng)減色效應(yīng)越明顯;如果導(dǎo)致 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的破壞,則產(chǎn)生增色效應(yīng)[18]。對(duì)于外來(lái)分子的特征吸收譜帶,若該分子與DNA發(fā)生嵌插作用,則該分子的吸收光譜發(fā)生減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象,且作用越強(qiáng)減色效應(yīng)越明顯;若該分子與DNA發(fā)生靜電作用,紫外吸收光譜峰將出現(xiàn)較小的紅移,且減色效應(yīng)不明顯[19]。

圖 6為殼聚糖加入后 DNA的紫外吸收光譜。殼聚糖在 260 nm附近沒(méi)有紫外吸收,DNA在 260 nm出現(xiàn)吸收峰,且隨著加入殼聚糖濃度的增加, DNA吸收光譜產(chǎn)生了明顯的增色效應(yīng)和較小的紅移。這些結(jié)果表明殼聚糖與 DNA之間可能由于靜電作用,發(fā)生相互作用而形成了新的復(fù)合物,導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞。

2.5 電化學(xué)分析

殼聚糖與DNA作用的循環(huán)伏安曲線(xiàn)如圖 7所示。曲線(xiàn) a,b,c分別表示裸金電極、DNA修飾金電極以及殼聚糖-修飾金電極在緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖。裸金電極曲線(xiàn)是典型的可逆的氧化還原過(guò)程,峰電流相對(duì)較大,0.55 V附近的還原峰是對(duì)應(yīng)的金氧化物的還原。DNA修飾金電極在 0.7 V附近產(chǎn)生了一個(gè)新峰。然而,在DNA修飾金電極上加入殼聚糖后,循環(huán)伏安曲線(xiàn)發(fā)生了明顯的變化,氧化還原峰電流急劇減小,而且沒(méi)有新的氧化還原峰出現(xiàn),這表明殼聚糖與 DNA分子之間發(fā)生了鍵合作用,形成的非電活性化合物不能在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)。溶液中自由殼聚糖分子的濃度減少,單位時(shí)間遷移到電極表面的殼聚糖分子數(shù)下降,導(dǎo)致峰電流減少。

圖 6 殼聚糖溶液的紫外吸收光譜Fig.6 Change ofUV spectra of the complex in the absence and presence of different concentrations ofDNA

圖 7 殼聚糖與DNA作用前后在緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.7 Cyclic voltammetry ofDNA and after incubation with chitosan in 0.1 mol/LNaH2PO4-Na2HPO4(pH 6.5)

3 結(jié)論

3.1 殼聚糖對(duì)E.coli和St.aureus有良好的抑制作用,殼聚糖的抑菌活性與其-NH2有關(guān)。

3.2 殼聚糖可能有一部分進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部,與DNA之間由于靜電作用而形成了新的復(fù)合物,導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞,進(jìn)而抑制細(xì)菌的繁殖。DNA與殼聚糖的可能作用模型如圖 8所示。

圖8 DNA與殼聚糖的作用模型Fig.8 Action models ofDNA and chitosan

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Interaction of Chitosan with DNA and Effect of Am ino Group on Antibacterial Activity

L IXiao-fang1,FENG Xiao-qiang1,FU Guo-qing2,YANG sheng1＊,SU Zhong-xing3

1College of Life Science and Chem istry,Tianshui Nor m al University;2TraditionalM edical hospital of Tianshui,Tianshui 741001,China;3Chem istry and Chem ical Engineering College,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China

The antibacterial activity of chitosan against Escherichia coli and Staphylococcus aureus were investigated by measuring inhibition zone.Aimed to explain the effect of amino group on antibacterial activity of chitosan,four different kinds of chitosan Schiff’s baseswere synthesized.UV absorption spectroscopy and electrochemical analysiswere used to illuminate the interaction of chitosan with DNA.The results showed that the antibacterial ability of chitosan was related to the amino group.Chitosan can bind with negative nucleic acids in cell,affect the normal replication function of DNA and ultimately inhibit the growth of bacteria.

chitosan;antibacterial activity;Schiff’s base;amino group;DNA

Q946.91;R285

A

1001-6880(2010)03-0373-06

2009-04-07 接受日期:2009-07-03

甘肅天水師范學(xué)院物理無(wú)機(jī)化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科基金

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:ysh@mail.tsnc.edu.cn