初金鑫,蔡文娣,韓寶芹,劉萬順,陳麗梅,連 波

1濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)部,濰坊 261053;2中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,青島 266003

單環(huán)刺螠纖溶酶UFE-Ⅰ的性質(zhì)和溶栓活性

初金鑫1,2＊,蔡文娣1,2,韓寶芹2,劉萬順2,陳麗梅1,連 波1

1濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)部,濰坊 261053;2中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,青島 266003

單環(huán)刺螠纖溶酶UFE-Ⅰ的最適反應(yīng)溫度為 45℃;最適反應(yīng) pH為 7.0;Mg2+、Mn2+和 Fe2+是該纖溶酶的強(qiáng)激活劑;Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+和 Pb2+對該纖溶酶具有一定的抑制作用;SBTI和 PMSF,完全抑制 UFE-Ⅰ,說明該酶為絲氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制劑部分抑制UFE-Ⅰ,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒較弱的抑制 UFE-Ⅰ。與蚓激酶類似,UFE-Ⅰ不僅具有直接的纖溶活力更具有纖溶酶原激活活力(84.0%),另外分別將蚓激酶原料與該酶加入到家兔血栓塊中,37℃孵育 3 h,結(jié)果表明該酶具有比蚓激酶更為強(qiáng)大的溶栓能力。

單環(huán)刺螠;纖溶酶;性質(zhì);溶栓活性

單環(huán)刺螠?zhǔn)屈S渤海沿岸底棲生物的常見種[1],前人從蟲體中分離到了螠速激肽Ⅰ-Ⅷ、血凝集素、腺苷三磷酸酶等生物活性物質(zhì)[2-6]。單環(huán)刺螠個體肥大,肉質(zhì)鮮美,體壁營養(yǎng)豐富[7],2006年,王佃亮等第一次從單環(huán)刺螠體腔液和內(nèi)臟中分離到了纖溶酶組分[8]。濰坊擁有中國唯一的單環(huán)刺螠種質(zhì)資源保護(hù)區(qū),研究單環(huán)刺螠具有重要意義和價值,為此,濰坊醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室較為詳細(xì)的研究了該酶的性質(zhì)并初步研究其溶栓活性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 單環(huán)刺螠纖溶酶 UFE-Ⅰ,中國海洋大學(xué)海洋生物活性物質(zhì)實(shí)驗(yàn)室制備;家兔,體重 2～2.5 kg,由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物基地提供。

1.1.2 試劑與儀器:蚓激酶 (earthwor m fibrinolytic enzyme EFE),取膠囊 3粒,稱其重量為 0.658 g,用生理鹽水溶解,過 0.22μm的濾膜將不溶性白色藥物輔料去除,上清液冷凍干燥,得 0.132 g凍干酶,以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定為 1651 U/mg,青島國大藥業(yè)有限公司;注射用尿激酶 (以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定為51226 U/mg),山東綠葉制藥有限公司;尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品 (每支含 830個單位,604-200020),中國藥品生物制品檢定所;;大豆胰蛋白酶抑制劑 (SBTI),上海三杰生物技術(shù)公司;纖溶酶原、凝血酶、纖維蛋白原、抑蛋白酶肽、糜蛋白抑制劑、對甲苯磺酰氟 (PMSF),美國 Sigma公司;苯甲脒、亮抑酶肽,Amresco公司;瓊脂糖,德國 Serva公司;其他試劑均為國產(chǎn)商品試劑分析純。AL-104電子精密天平,梅特勒-托利多儀器公司;A IR TECH超凈工作臺,安泰公司;XD-101倒置顯微鏡,南京江南光電公司。

1.1.3 家兔,由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物基地提供。

1.2 方法

1.2.1 酶的制備

單環(huán)刺螠體腔液經(jīng)硫酸銨沉淀、超濾、離子交換層析、凝膠過濾進(jìn)行分離純化,得到的單一洗脫峰酶組分,經(jīng)Native-PAGE、SDS-PAGE和飛行質(zhì)譜分析,確定了 UFE-Ⅰ純度 99%以上和相對分子量為23887.23±0.28Da[9]。

1.2.2 酶活力測定

參照經(jīng)典瓊脂糖纖維蛋白平板法[10],并作適當(dāng)改進(jìn)。將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同濃度的溶液點(diǎn)樣100μL于纖維蛋白平板上的牛津杯中,37℃孵育18 h后測量溶圈互相垂直的兩個直徑,以兩直徑的乘積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)酶活力為橫坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算UFE-Ⅰ的纖溶活力。

1.2.3 最適反應(yīng)溫度的測定

將加樣后的纖維蛋白平板分別放入 25、30、35、40、45、50、55℃的恒溫箱中,pH 7.8保溫 1 h后取出,測各個溶圈的垂直直徑,找出 UFE-Ⅰ作用的最適溫度。

1.2.4 最適反應(yīng) pH的測定

采用 pH 2.6～12.0的廣泛緩沖液[11],分別制作 pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8. 5、9.0、9.5和 10.0的平板。其他條件均相同,37℃保溫 18 h后取出測各平板中溶圈的垂直直徑,以確定UFE-Ⅰ作用的最適 pH。

1.2.5 激活劑或抑制劑對酶活力的影響

采用幾種不同的金屬離子和蛋白酶抑制劑分別作用于UFE-Ⅰ,以不添加任何金屬離子或蛋白酶抑制劑時的酶活力為 100%。

1.2.6 激酶活力的測定

在 80℃加熱 30 min的纖維蛋白平板上,纖溶酶原失活,測得 UFE-Ⅰ的直接纖溶活力;而在標(biāo)準(zhǔn)平板上,該酶可能與被激活的纖溶酶原共同起作用,測得總活力,UFE-Ⅰ激酶活力 =總活力-直接纖溶活力。

1.2.7 體外溶栓活性的測定

試驗(yàn)設(shè)生理鹽水空白對照組,蚓激酶 (EFE)陽性對照組,UFE-Ⅰ酶試驗(yàn)組,分別用生理鹽水配制不同濃度的溶液。家兔靜脈取血,取滅菌試管 15支分別加入新鮮血液 1.0 mL,靜置待血液完全凝固,分別加入酶液 1.0 mL。每組做 3個平行樣。于 37℃保溫振搖,觀察各試管血栓的形態(tài)顏色和溶解變化。以任何一組血塊完全溶解為酶水解終點(diǎn),生理鹽水漂洗血栓 3次,濾紙吸去多余水分,剩余血塊稱重。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 最適反應(yīng)溫度

以瓊脂糖纖維蛋白平板法測得的單環(huán)刺螠纖溶酶UFE-Ⅰ在 6種不同溫度 (25、30、35、40、45、50、55℃)條件下的酶活力如圖 (圖 1)所示。該酶的最適反應(yīng)溫度約為 45℃。

圖 1 溫度對酶活力的影響Fig.1 Effect of temperature on the enzyme activity

2.2 酶的最適反應(yīng) pH

以瓊脂糖纖維蛋白平板法測得的單環(huán)刺螠纖溶酶 UFE-Ⅰ在不同 pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和 10.0)條件下的酶活力如圖(圖 2)所示。從結(jié)果看,酶的最適 pH約為7.0,在 pH 6.5～7.5范圍內(nèi),酶活力都很高。

圖 2 pH對酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on the enzyme activity

2.3 激活劑或抑制劑對酶活力的影響

Mg2+、Mn2+和 Fe2+離子能夠顯著地提高 UFE-Ⅰ活力,是該酶的強(qiáng)激活劑;Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+和 Pb2+對酶活力的具有一定的抑制作用;SBTI和PMSF完全抑制UFE-Ⅰ,說明該酶為絲氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制劑部分抑制 UFE-Ⅰ,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒都較弱的抑制該酶(表 1)。

表 1 不同金屬離子或抑制劑對酶活力的影響(±s,n=3)Table 1 Effecton the enzyme activity ofmetal ions or inhibitors(±s,n=3)

表 1 不同金屬離子或抑制劑對酶活力的影響(±s,n=3)Table 1 Effecton the enzyme activity ofmetal ions or inhibitors(±s,n=3)

2.4 激酶活力測定

0,40,80,120,160,200為稀釋后的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品活力單位梯度,U1,U2,U3為 0.005、0.05、0.5 mg/mL的UFE-Ⅰ溶液。得到UFE-Ⅰ纖溶活性分布見表 2。

圖 3 非加熱平板的纖溶活性Fig.3 Fibrinolytic ability of the non-heated plates

圖 4 加熱平板的纖溶活性Fig.4 Fibrinolytic ability of the heated plates

表 2 UFE-Ⅰ纖溶活性分布(±s,n=3)Table 2 Constitute of fibrinolytic activity ofUFE-Ⅰ(±s,n=3)

表 2 UFE-Ⅰ纖溶活性分布(±s,n=3)Table 2 Constitute of fibrinolytic activity ofUFE-Ⅰ(±s,n=3)

分布Constitute酶活力(U/mg) Fibrinolytic activity活力分布(%) Distribution of activity總活性Total activity 4672±57.3 100直接纖溶活性Direct fibrinolytic activity 748.3±23.6 16.0激酶活性Kinase activity 3924±57.3 84.0

2.5 兩種酶不同濃度下水解血栓速度的比較

酶水解血栓 3 h后,UFE-Ⅰ組 (1 mg/mL)肉眼已看不到栓塊,取出殘余血塊,觀察下圖 (圖 5)可見,UFE-Ⅰ組(1 mg/mL)溶解血栓最快;其次為 EFE組(20 mg/mL)。EFE組 (2 mg/mL)栓塊的質(zhì)量出現(xiàn)增加的現(xiàn)象,可能是 EFE使栓塊膨松后吸水的結(jié)果。殘余血栓稱重結(jié)果見表(表 3)[9],表明 UFE-Ⅰ有強(qiáng)大的溶栓作用。

圖 5 血栓溶解實(shí)驗(yàn)中殘留的血栓Fig.5 The remained rabbit thrombuses after thrombolytic test

表 3 殘余血栓的質(zhì)量(±s,n=3)Table 3 Mass of the remained thrombuses(±s,n=3)

表 3 殘余血栓的質(zhì)量(±s,n=3)Table 3 Mass of the remained thrombuses(±s,n=3)

組別Group劑量Dose(mg/mL)殘余栓塊質(zhì)量(g) Thrombusesmass(g) Control - 0.508±0.006 UFE-Ⅰ 1 0.001±0.000＊#

＊P＜0.01,vs control;#P＜0.05,vs EFE(20 mg/mL)

3 討論

UFE-Ⅰ作為一種新型的纖溶酶具有以下的性質(zhì)特點(diǎn):最適反應(yīng)溫度為 45℃;最適反應(yīng) pH為7.0;Mg2+、Mn2+和 Fe2+離子能夠顯著地提高該酶活力,是 UFE-Ⅰ的強(qiáng)激活劑;Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+和 Pb2+對酶活力的具有一定的抑制作用;SBTI和PMSF均為絲氨酸蛋白酶抑制劑,完全抑制UFE-Ⅰ,說明該酶為絲氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制劑部分抑制UFE-Ⅰ,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒都是類胰蛋白酶的抑制劑,且不抑制糜蛋白酶[12],它們均較弱的抑制 UFE-Ⅰ,說明 UFE-Ⅰ有較強(qiáng)的類糜蛋白酶活性和較弱的類胰蛋白酶活性。作用于底物時,可能更易于作用于芳香環(huán)側(cè)鏈氨基酸的羧基肽鍵; UFE-Ⅰ主要具有纖溶酶原激活活性 (84.0%),而直接水解纖維蛋白的活性比較弱(16.0%)。

另外UFE-Ⅰ具有強(qiáng)大的溶解家兔栓塊的能力,強(qiáng)于 20倍的蚓激酶原料。海洋無脊椎動物單環(huán)刺螠資源豐富,且可望通過人工方法進(jìn)行規(guī)?；B(yǎng)殖。因此,開展單環(huán)刺螠纖溶酶的研究,探討其醫(yī)用價值,不僅對開發(fā)海洋生物新藥提供新思路新資源,同時對海洋經(jīng)濟(jì)的發(fā)展也起到積極的推動作用。

1 Li FL(李鳳魯),WangW(王瑋),Zhou H(周紅).Studies on the echiurans(echiura)of the Yellow Sea(Huanghai) and Bohai Sea.J Ocean Univ Q ingdao(青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)),1994,24:203-210.

2 Ikeda T,Minakata H,Nomoto K,et al.Two novel tachykininrelated neuropeptides in the echiuroid worm,U rechis unicinctus.B iochem ical and B iophysical Research Comm unications, 1993,192(1):1-6.

3 Kawada T,et al.A novel tachykinin-related peptide receptor Sequence,genomic organization,and functional analysis.Europe Journal of B iochem istry,2002,269:4238-4246.

4 Kawada T,Masuda K,Satake H,et al.Identification ofmultiple urechistachykinin peptides,gene expression,pharmacological activity,and sdetection usingmass spectrometric analyses.Peptides,2000,21:1777-1783.

5 Ozeki Y,Tazawa E,Matsui T.D-Galactoside-specific lectins from the body wall of an echiuroid(U rechis unicinctus)and two annelids(Neanthes japonicaandM sanguinea).Comparative B iochem istry and Physiology,1997,118B(1):1-6.

6 Maruyama K.Adenosinetriphosphatase activity of the contractile protein from the body-wall muscle of the echiuroid,U rechis unicinctus.Enzym ologia,1954,17(2):90-94.

7 Yang G W(楊桂文),AnLG(安利國),Sun ZJ(孫忠軍). Analysis of nutrient composition inU rechis unicinctus.M arine Sci(海洋科學(xué)),1999,6:13-14.

8 WangDL(王佃亮),LiuWS(劉萬順),Han BQ(韓寶芹),et al.Study on anticoagulant and thrombolytic effects of a novelmarine fibrinolytic enzymein vitro.Chin J M arine D rugs(中國海洋藥物),2006,4:37-42.

9 Guo JM(郭金明),Han BQ(韓寶芹),et al.Isolation and purification of fibrinolytic enzyme fromU rechis unicinctusand primary study of its character.Periodical of Ocean Univ China(中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)),2008,6:951-954.

10 Astrup T,Müllertz S.The fibrin plate method for est imating fibrinolytic activity.A rchives of B iochem istry and B iophysics, 1952,40:346-351.

11 Zhao YF(趙永芳).Principle and Application of Measurement for Biochemistry.Wuhan:Wuhan University Press, 1994.418.

12 Hahn BS,et al.Purification and characterization of a serine protease with fibrinolytic activity fromTenodera sinensis(prayingmantis).BBA-Protein StructM,1999,1430:376-386.

Characterization and Thrombolysis Activity of Fibrinolytic Enzyme UFE-I fromU rechis unicinctus

CHU Jin-xin1,2＊,CA IWen-di1,2,HAN Bao-qin2,L IU Wan-shun2,CHEN Li-mei1,L IAN Bo1

1Departm ent of Preclinical m edicine,W eifang M edical College,W eifang,261053,China;2College of M arine Life Sciences,Ocean University of China,Q ingdao,266003,China

The optimum temperature ofUFE-Ⅰwas about 45℃.The optimum pH was about 7.0.Itwas discovered that Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+and Pb2+ionswere inhibitors ofUFE-Ⅰ,andMg2+、Mn2+and Fe2+ionswere activators of this enzyme.SBTI(soybean trypsin inhibitor)and PMSF(pheny lmethyl sulfonylfluoride)completely inhibited UFE-Ⅰ, which indicated that the enzyme belonged to serine protease group,chymotrypsin inhibitor fractionaly inhibited UFE-Ⅰ, leupeptin、aprotinin and benzamidine inhibited UFE-Ⅰweakly.Like lumbrokinase,UFE-Ⅰcan not only directly degrade fibrin but also indirectly hydrolyze fibrin through transfor ming plasminogen into plas min(84.0%).when each enzyme and rabbit thrombuswas incubated at 37℃ for 3 h.The results showed that UFE-Ⅰhad stronger thrombolytic ability than lumbrokinase.

U rechis unicinctus;fibrinolytic enzyme;characterization;thrombolysis activity

Q503

A

1001-6880(2010)04-0661-04

2009-11-12 接受日期:2010-01-15

＊通訊作者 Tel:86-536-8462052;E-mail:jxchu_81@yahoo.com