劉雅波,陶文沂

1江南大學醫(yī)藥學院,無錫 214122;2江南大學教育部工業(yè)生物技術重點實驗室,無錫 214122

18種青黛 7-氮雜靛玉紅對 6種腫瘤細胞增殖的影響

劉雅波1,陶文沂2＊

1江南大學醫(yī)藥學院,無錫 214122;2江南大學教育部工業(yè)生物技術重點實驗室,無錫 214122

本文闡述了利用MTT法測定青黛中18種 7-氮雜靛玉紅衍生物對 6種腫瘤細胞增殖的抑制作用。化合物 1～18(1.25～20μmol/L)處理腫瘤細胞 72 h后,觀測細胞生長抑制作用,分析其結構-療效關系。結果發(fā)現(xiàn)具有相同結構特征即 R位上的N-OH基團和 R3′位上的Br(Cl)基團的化合物 10～15可顯著抑制 6種腫瘤細胞的增殖,與此相反,無此結構特征的化合物 1～9的抑制作用大大降低。初步確定,R位上的N-OH基團和 R3′位上的Br(Cl)基團是 7-氮雜靛玉紅衍生物抗腫瘤作用的主要活性部位。

青黛;7-氮雜靛玉紅;靛玉紅;抗腫瘤活性;MTT法;IC50值

青黛為爵床種植物馬藍B aphicacanthus cusia(Ness)Bremek.蓼科植物蓼藍Polygonum tinctoriumAit.豆科植物木藍Indigofrra tinctoriaL.或十字花科植物菘藍 Isatis indigotica Fort.的莖葉經(jīng)加工制得的粉末狀物或團塊,主產(chǎn)于福建、云南、江蘇、安徽等地,以福建產(chǎn)者質(zhì)量最佳,為建青黛。傳統(tǒng)醫(yī)學認為,青黛具有清熱解毒,涼血止血、清肝瀉火等功能,對溫病熱盛、斑疹、吐血、咯血、小兒驚癇、瘡腫、丹毒、濕疹等病證有良好的療效?，F(xiàn)代藥理學研究表明[1]:青黛具有抗菌和抗腫瘤等藥理作用。

靛玉紅 (indirubin)是中國在 70年代中期自主開發(fā)的抗腫瘤藥物,它是從青黛中分離得到的抗腫瘤有效成分[2]。靛玉紅及其衍生物是一類雙吲哚雜環(huán)平面結構的化合物。國外學者近年來對靛玉紅及其衍生物抗癌機理的研究表明[3,4],靛玉紅及其衍生物對細胞內(nèi)廣泛存在的細胞周期依賴性蛋白激酶 (CDK)具有抑制作用,導致癌細胞的細胞周期停滯,從而抑制腫瘤細胞增殖。為進一步探討靛玉紅衍生物的抗腫瘤活性成分,我們用氮原子置換了原先靛玉紅分子吲哚苯環(huán) 7號位上的碳原子,獲得了新型的 7-氮雜靛玉紅分子,并在此基礎上進行了一系列的化學結構修飾,設計制得 59種 7-氮雜靛玉紅衍生物[5]。本文首次對其中的 l8種單體化合物進行了體外抗腫瘤活性評價。

圖 1 受試化合物的化學結構Fig.1 Chemical structure of the tested compounds

表 1 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物的結構Table 1 Chemical structure of eighteen 7-nitrogen substituted indirubin derivatives

1 材料與方法

1.1 藥物

18種 7-氮雜靛玉紅衍生物均由無錫杰西醫(yī)藥公司程景才老師提供,全部經(jīng)紅外光譜 (IR)、紫外光譜(UV/V IS)、質(zhì)譜 (ESI-MS)、氫譜 (1H NMR)和元素分析結構確證,其化學結構見圖 1和表 1;陽性對照藥 N-1-甲基異靛藍(甲異靛片,北京協(xié)和藥廠,批號 H 20010652)。

1.2 細胞株

人白血病細胞株 HL-60、人卵巢癌細胞株 SKOV-3和人肝癌細胞株 Bel-7402由中科院上海藥物研究所提供;人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、人肝癌細胞株 HepG-2和小鼠黑色素瘤細胞株 B16由江南大學醫(yī)藥學院提供。

1.3 試劑與儀器

RPM IMedium 1640(批號 P1502,Gibco公司); DMEM Medium(批號 D1248,Gibco公司);胰蛋白酶 (批號 T0309,Gibco公司 );胎牛血清 (批號030909,Gibco公司);噻唑藍 (MTT,批號 BS0887, Sino American biotec);HEPES(批號 B0021,Sanland-Chem International);L-谷氨酰胺 (批號 G0431,Sigma公司);二甲基亞砜 (DMSO,批號 T0724,Sigma公司)。

CO2培養(yǎng)箱 (Thermos8000,Ther mos);倒置相差顯微鏡 (CKX41,Olympus);酶標儀 (RS-232C, Thermos);低溫高速離心機 (J2-HS,Beckman公司);磁力攪拌器(95-1,上海安亭電子儀器廠);電熱恒溫水槽(DK-8D型,上海精宏實驗設備有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 藥物制備

受試化合物以DMSO配置成濃度為20 mmol的儲備液,-20℃保存?zhèn)溆谩嶒灂r以 RPM I 1640或DMEM培養(yǎng)液 (含 10%的滅活胎牛血清,100μg/ mL的青鏈霉素)稀釋,配制成梯度濃度為 1.25～20 μmol/L含藥培養(yǎng)液(藥物濃度以 2倍遞增)。

1.4.2 腫瘤細胞培養(yǎng)

以 RPM I 1640培養(yǎng)液 (含 10%的滅活胎牛血清,100μg/mL的青鏈霉素)按照一般懸浮細胞傳代培養(yǎng)的方法[6]培養(yǎng)白血病 HL-60細胞;以 RPM I 1640培養(yǎng)液(含 10%的滅活胎牛血清,100μg/mL的青鏈霉素)按照一般貼壁細胞傳代培養(yǎng)的方法[7]培養(yǎng)人肝癌 BEL-7402,人乳腺癌 MDA-MB-231和小鼠黑色素瘤B16細胞;以DMEM培養(yǎng)液(含10%的滅活胎牛血清,100μg/mL的青鏈霉素)按照一般貼壁細胞傳代培養(yǎng)的方法[8]培養(yǎng)人卵巢癌 SK-OV-3和人肝癌 HepG-2細胞。腫瘤細胞置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每 2～3 d傳代一次。實驗時取對數(shù)生長期細胞,混勻后計數(shù),苔盼藍染色。實驗用活細胞應在 98%以上。

1.4.3 實驗分組

取小鼠黑色素瘤 B16、人肝癌 HepG-2、人肝癌BEL-7402、人白血病 HL-60、人卵巢癌 SK-OV-3和人乳腺癌MDA-MB-231 6株細胞瘤株。每個瘤株設有 20、10、5、2.5、1.25μmol/L濃度梯度的試藥組,另設培養(yǎng)液陰性對照組和甲異靛陽性對照組,每一濃度設 8個復孔。

1.4.4 MTT法測定 7-氮雜靛玉紅衍生物對腫瘤細胞株的抑制作用[9]

取對數(shù)生長期細胞,離心,計數(shù),以含 10%的滅活胎牛血清的 RPM I 1640或 DMEM培養(yǎng)液配成細胞濃度為 2.5×104/mL的細胞懸液,接種于 96孔板,每孔約 5000個細胞/200μL。細胞株于 37℃, 5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h后,分別加入上述藥物濃度(共接種7組,包括 2個對照組),每組設立 8個復孔。孵育 72 h后,進行MTT快速比色,在酶標儀上以 540 nm為測定波長,630 nm為參比波長測定吸光度(A)值。

細胞生長抑制率(%)=100×(1-實驗組平均A540/陰性對照組平均 A540)

細胞生長抑制指數(shù)通過 I C50(藥物半數(shù)抑制濃度)來表示,以濃度-抑制率曲線求出回歸方程,得出50%抑制濃度 (I C50)。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)來自 4次獨立實驗,所有數(shù)據(jù)以 x ±s表示,并采用 SPSS統(tǒng)計軟件進行處理組間和區(qū)組間方差分析。

2 結果與討論

青黛為我國傳統(tǒng)中藥材,歷史悠久,具有較為廣泛的生物活性。近些年來,國內(nèi)外的藥物化學工作者對青黛中抗腫瘤有效成分——靛玉紅衍生物進行了廣泛的結構修飾,以改善其溶解性,進而增強其抗腫瘤活性[10,11]。與靛玉紅衍生物相比,7-氮雜靛玉紅衍生物改變了其母核結構,即用氮原子置換了原先靛玉紅分子吲哚苯環(huán) 7號位上的碳原子。有研究表明[5]:7-氮雜靛玉紅類衍生物的脂溶性和水溶性都有所提高,預示其抗腫瘤活性有望增強。本文通過MTT實驗,對新合成的 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物進行了體外抗腫瘤活性研究。MTT實驗,即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色實驗,是一種檢測細胞存活和生長的有效方法,該方法已廣泛用于一些生物活性因子的檢測,大規(guī)模的抗腫瘤藥物的篩選,細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高,重復性好[12]。

表 2 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物對人肝癌細胞株 Bel-7402增殖的抑制作用(±s,n=4,72 h)Table 2 Effect of 18 compounds on Bel-7402 cell viability(±s,n=4,72 h)

表 2 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物對人肝癌細胞株 Bel-7402增殖的抑制作用(±s,n=4,72 h)Table 2 Effect of 18 compounds on Bel-7402 cell viability(±s,n=4,72 h)

藥物Drug細胞增殖抑制率(%,對照組)Inhibitory rate(%,control) 1.25μmol/L 2.5μmol/L 5μmol/L 10μmol/L 20μmol/L IC50(μmol/L) 1 32.45±0.97＊41.72±1.94＊48.66±0.68＊57.87±0.23＊73.93±0.23＊7.32 2 35.73±0.93＊44.90±0.12＊57.39±0.92＊69.58±2.37＊80.05±1.09＊4.76 3 38.46±0.37＊＊45.35±0.63＊60.12±2.64＊74.95±2.51＊83.49±0.52＊3.87 4 26.47±1.58 34.87±0.42 45.02±1.75 58.68±1.26＊72.33±1.27＊8.76 5 34.67±0.52＊41.48±1.07＊49.95±1.57＊71.54±1.84＊82.39±0.89＊5.59 6 35.68±2.09＊46.53±0.87＊61.97±0.14＊68.11±1.39＊80.89±0.63＊4.37 7 35.58±1.47＊48.23±0.09＊69.07±0.86＊＊76.58±0.63＊＊83.42±0.71＊3.68 8 37.72±1.27＊＊47.56±1.32＊63.24±2.13＊72.63±0.53＊82.79±0.64＊3.65 9 36.48±0.59＊＊49.12±1.59＊65.49±1.04＊75.36±1.74＊＊83.34±0.41＊3.54 10 40.12±1.74＊＊54.87±0.42＊＊71.48±0.05＊＊83.63±1.56＊＊90.59±0.23＊＊1.91 11 44.52±0.62＊＊53.39±2.89＊＊74.68±1.35＊＊80.75±0.78＊＊89.67±0.48＊＊1.22 12 39.53±1.49＊＊60.14±1.83＊＊71.46±0.31＊＊78.87±1.09＊＊90.84±0.86＊＊1.70 13 44.02±0.21＊＊54.13±0.61＊＊66.32±1.28＊＊81.79±1.07＊＊93.47±0.42＊＊1.32 14 44.79±138＊＊52.87±0.59＊＊69.07±0.25＊＊83.21±1.78＊＊91.42±0.75＊＊1.28 15 44.12±0.23＊＊53.47±1.37＊＊65.61±0.19＊74.06±1.21＊88.65±0.67＊＊1.42 16 43.95±0.09＊＊52.34±0.47＊＊62.89±1.17＊78.67±0.42＊＊87.36±0.59＊＊1.78 17 39.04±0.36＊＊57.42±0.62＊＊65.53±1.74＊72.84±0.36＊84.72±0.27＊2.23

注:與甲異靛組相比:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。Note:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01 vsmeisoindigo group.

表 3 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物對人白血病細胞株 HL-60增殖的抑制作用(±s,n=4,72 h)Table 3 Effect of 18 compounds on HL-60 cell viability(±s,n=4,72 h)

表 3 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物對人白血病細胞株 HL-60增殖的抑制作用(±s,n=4,72 h)Table 3 Effect of 18 compounds on HL-60 cell viability(±s,n=4,72 h)

注:與甲異靛組相比:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。Note:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01 vsmeisoindigo group.

表 4 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物對人卵巢癌細胞株 SK-OV-3增殖的抑制作用(±s,n=4,72 h)Table 4 Effect of 18 compounds on SK-OV-3 cell viability(±s,n=4,72 h)

表 4 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物對人卵巢癌細胞株 SK-OV-3增殖的抑制作用(±s,n=4,72 h)Table 4 Effect of 18 compounds on SK-OV-3 cell viability(±s,n=4,72 h)

藥物Drug細胞增殖抑制率(%,對照組)Inhibitory rate(%,control) 1.25μmol/L 2.5μmol/L 5μmol/L 10μmol/L 20μmol/L IC50(μmol/L) 1 27.49±1.78＊＊38.24±0.55＊46.58±1.92＊60.14±2.99＊76.85±0.15＊7.80 2 35.89±1.35＊＊43.71±1.38＊63.16±1.58＊71.50±1.43＊78.22±0.13＊4.62 3 38.03±2.26＊＊46.38±2.75＊＊62.15±4.64＊74.67±0.78＊80.59±0.02＊3.85 4 29.19±0.52＊＊39.41±0.32＊46.12±3.67＊58.37±2.88＊71.60±0.09＊8.22 5 23.45±3.54＊34.08±3.62＊48.21±0.17＊67.79±1.62＊83.30±0.28＊7.34 6 34.76±0.32＊＊48.39±2.89＊＊64.47±0.29＊＊75.10±0.38＊83.98±0.11＊3.89 7 36.48±1.22＊＊47.79±1.68＊＊60.85±1.03＊75.37±2.64＊82.95±0.89＊3.88 8 38.76±0.44＊＊48.89±0.63＊＊62.45±0.83＊70.64±0.25＊81.23±0.47＊3.45 9 40.63±1.85＊＊49.21±0.19＊＊60.34±0.38＊71.57±1.36＊82.29±0.28＊3.11 10 38.02±1.20＊＊64.26±1.07＊＊72.79±1.49＊＊81.12±0.48＊＊90.43±0.73＊＊1.65 11 42.33±0.67＊＊54.36±0.05＊＊75.71±0.47＊＊83.62±1.95＊＊90.45±0.81＊＊1.56

注:與甲異靛組相比:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。Note:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01 vsmeisoindigo group.

表 5 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖的抑制作用(±s,n=4,72 h)Table 5 Effect of 18 compounds onMDA-MB-231 cell viability(±s,n=4,72 h)

表 5 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖的抑制作用(±s,n=4,72 h)Table 5 Effect of 18 compounds onMDA-MB-231 cell viability(±s,n=4,72 h)

注:與甲異靛組相比:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。Note:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01vsmeisoindigo group.

藥物Drug細胞增殖抑制率 (%,對照組)Inhibitory rate(%,control) 1.25μmol/L 2.5μmol/L 5μmol/L 10μmol/L 20μmol/L IC50(μmol/L) 1 32.47±0.29＊40.09±1.53＊49.64±0.76＊62.36±0.66＊81.23±0.88＊6.52 2 35.26±1.26＊＊46.89±0.99＊57.97±1.24＊71.68±0.36＊82.70±0.07＊4.40 3 36.21±1.75＊45.87±1.56＊65.35±0.20＊＊73.24±1.47＊83.76±0.42＊3.94 4 26.38±1.43 34.65±3.39 46.51±1.84＊60.29±0.73＊71.47±1.93＊8.59 5 32.56±0.31＊45.63±2.85＊61.79±0.63＊71.46±1.44＊77.14±2.03＊5.00 6 38.07±0.89＊＊47.53±0.92＊63.25±1.52＊74.38±0.78＊80.21±0.64＊3.69 7 37.70±0.77＊＊47.83±0.72＊65.97±1.14＊＊79.26±2.46＊＊83.31±0.73＊3.46 8 39.27±0.28＊＊48.38±0.61＊62.16±1.86＊73.62±0.55＊81.39±0.36＊3.37 9 41.03±3.22＊＊48.69±1.26＊60.94±0.07＊72.36±1.48＊83.21±0.27＊3.03 10 41.14±0.55＊＊59.02±0.54＊＊72.36±1.54＊＊81.29±1.94＊＊89.78±0.28＊＊1.30 11 38.79±1.31＊＊59.33±1.33＊＊70.16±0.87＊＊81.27±0.36＊＊90.05±0.53＊＊1.80 12 41.67±0.06＊＊57.26±0.40＊＊67.74±0.24＊＊76.88±1.60＊＊89.93±0.15＊＊1.40 13 39.46±0.64＊＊56.75±1.08＊＊69.84±2.85＊＊80.14±0.74＊＊88.52±0.19＊＊1.93 14 43.25±0.21＊＊56.49±1.49＊＊71.08±1.33＊＊83.37±1.53＊＊92.10±0.26＊＊1.07 15 39.79±0.90＊＊57.63±1.38＊＊68.58±0.74＊＊76.40±0.89＊＊89.64±0.55＊＊1.78 16 38.95±1.85＊＊56.89±0.82＊＊66.13±2.68＊＊75.46±2.55＊86.22±0.49＊＊2.19 17 41.46±0.53＊＊56.39±0.18＊＊68.82±0.37＊＊78.27±1.32＊＊86.52±0.30＊＊1.59 18 42.26±0.28＊＊48.23±2.95＊63.72±0.91＊74.94±1.80＊85.17±0.77＊2.65甲異靛meisoindigo17.33±0.74 25.94±0.15 32.16±2.47 38.25±0.92 52.48±0.06 17.09

表 6 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物對人肝癌細胞株 HepG-2增殖的抑制作用(±s,n=4,72 h)Table 6 Effect of 18 compounds on HepG-2 cell viability(±s,n=4,72 h)

藥物Drug細胞增殖抑制率 (%,對照組)Inhibitory rate(%,control) 1.25μmol/L 2.5μmol/L 5μmol/L 10μmol/L 20μmol/L IC50(μmol/L) 1 28.76±0.02＊36.52±3.63＊48.45±0.03＊61.39±2.38＊76.23±0.98＊7.64 2 33.28±2.48＊45.76±1.82＊57.32±1.72＊67.91±1.36＊82.87±0.12＊4.96 3 37.89±1.39＊＊47.18±2.26＊60.27±1.17＊71.35±0.75＊82.43±0.74＊3.85 4 25.27±2.66 32.78±1.72 41.49±2.79 56.94±2.74＊75.36±0.70＊9.11 5 31.57±2.38＊42.62±1.29＊54.29±1.03＊67.45±5.77＊81.26±0.20＊5.75

注:與甲異靛組相比:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。Note:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01 vsmeisoindigo group.

表 7 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物對小鼠黑色素瘤細胞株 B16增殖的抑制作用(±s,n=4,72 h)Table 7 Effect of 18 compounds on B16 cell viability(±s,n=4,72 h)

表 7 18種 7-氮雜靛玉紅衍生物對小鼠黑色素瘤細胞株 B16增殖的抑制作用(±s,n=4,72 h)Table 7 Effect of 18 compounds on B16 cell viability(±s,n=4,72 h)

注:與甲異靛組相比:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。Note:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01 vsmeisoindigo group.

藥物Drug細胞增殖抑制率 (%,對照組)Inhibitory rate(%,control) 1.25μmol/L 2.5μmol/L 5μmol/L 10μmol/L 20μmol/L IC50(μmol/L) 1 35.74±0.07＊＊42.86±1.45＊49.02±0.51＊63.67±0.52＊79.41±0.26＊5.97 2 32.57±0.08＊＊43.21±1.18＊59.30±3.70＊74.93±0.39＊83.89±0.09＊4.88 3 38.45±0.22＊＊47.12±2.06＊58.38±1.97＊76.27±1.86＊83.71±0.03＊3.76 4 26.46±0.03＊35.93±1.24＊43.72±1.33＊57.09±1.26＊73.28±0.02＊8.84 5 33.57±1.83＊＊45.02±2.07＊59.35±0.37＊70.48±0.88＊79.90±0.48＊4.91 6 32.18±2.68＊＊41.37±0.65＊48.52±0.59＊66.39±1.60＊79.15±0.42＊4.33 7 36.76±0.57＊＊46.57±1.76＊61.33±2.76＊72.42±2.40＊81.76±0.33＊4.04 8 38.68±0.32＊＊47.26±1.60＊63.42±1.42＊＊74.33±0.70＊81.15±0.69＊3.56 9 39.42±0.78＊＊47.59±0.44＊62.31±1.87＊75.60±1.17＊82.94±0.99＊3.36 10 43.87±0.38＊＊53.24±0.32＊＊72.39±2.86＊＊81.35±1.29＊＊91.70±0.51＊＊1.30 11 43.26±2.53＊＊54.78±3.75＊＊65.14±1.21＊＊79.52±2.17＊＊90.39±0.17＊＊1.45 12 41.65±1.12＊＊58.31±0.83＊＊67.89±1.20＊＊78.43±0.21＊＊89.17±0.48＊＊1.31 13 40.35±1.31＊＊58.26±1.45＊＊68.37±1.11＊＊79.84±2.38＊＊91.19±0.27＊＊1.56 14 41.23±2.68＊＊56.42±1.58＊＊68.51±1.05＊＊77.18±1.86＊＊89.74±0.06＊＊1.57 15 39.58±1.90＊＊56.14±2.42＊＊67.97±1.60＊＊79.26±0.09＊＊90.34±0.05＊＊1.94 16 41.83±1.72＊＊52.97±1.58＊＊61.79±3.33＊73.06±0.07＊84.62±0.14＊2.22 17 39.68±1.43＊＊50.87±1.60＊＊62.29±1.24＊74.30±1.52＊85.72±0.30＊2.84 18 41.38±1.79＊＊48.17±0.36＊64.47±1.76＊＊75.39±0.37＊84.24±0.57＊2.81甲異靛meisoindigo14.52±0.04 25.09±0.76 31.74±1.31 44.68±0.43 56.96±1.53 14.50

N-1-甲基異靛藍(甲異靛)是一種已用于臨床治療的靛玉紅類抗腫瘤藥物[13]。本MTT檢測結果顯示:與陽性對照藥甲異靛相比,所有 18個 7-氮雜靛玉紅衍生物在體外對 6種細胞瘤株均具有較好的抑制活性,它們的 I C50(μmol/L)在 1.06～9.12之間(表 2～7),其抗腫瘤活性比甲異靛強,且同一種衍生物對 6種不同腫瘤細胞的細胞毒作用無明顯差異。對靛玉紅衍生物電子結構與抗癌活性的構效關系的研究表明[14]:靛玉紅衍生物的藥效基團是 3號位碳原子,其上富集著負電荷,有活性的靛玉紅衍生物在與腫瘤細胞的作用過程中是通過與受體的正電性原子結合而對腫瘤細胞產(chǎn)生抑制作用的。7-氮雜靛玉紅衍生物 7號位氮原子的靜電作用,降低了 3號位碳原子的凈電荷數(shù)量,碳原子的負電性越大,它與受體的正電性原子結合能力就越強,對腫瘤細胞的抑制活性也越高。因此與靛玉紅衍生物相比,7-氮雜靛玉紅衍生物的抗腫瘤活性得到了顯著提高。

本研究發(fā)現(xiàn),化合物 10～15在 20μmol/L的濃度下作用 72 h對本實驗所用 6種腫瘤細胞株均有很強的抑制作用,抑制率大都在 88%～93%,抑制作用基本上隨著濃度的增高而增強?；衔?16～18在 20μmol/L的濃度下對實驗所用 6種腫瘤細胞株均有較強的抑制作用,抑制率大都在 85%左右。化合物 1～9在 1～20μmol/L濃度范圍對實驗所用 6種腫瘤細胞增殖的抑制作用均較弱,抑制率幾乎均在 84%以下(表 2～7)。由以上 18種化合物的化學結構可知:具有明顯抗腫瘤活性的化合物10～15均具有相同的結構特征,即具有 R位上的N-OH基團和R3′位上的Br(Cl)基團。與此相反,無此結構特征的化合物 1～9的抗腫瘤活性降低?；衔?16～18在結構上只有 R3′位上的Br(Cl)基團,而無 R位上的N-OH基團,其抗腫瘤活性位于上述兩者之間。綜上所述,推測 7-氮雜靛玉紅衍生物分子構型中,R位上的 N-OH基團和 R3′位上的 Br (Cl)基團可能是其具有顯著抗腫瘤活性的重要結構修飾基團,苯環(huán) 3′位和 5′位可能是其抗腫瘤作用的主要活性部位,這和近年來國外對于靛玉紅衍生物的研究結果是相似的[15]。

腫瘤分子生物學研究顯示,靛玉紅及其衍生物是通過抑制細胞周期激酶 (CDK)發(fā)揮抗腫瘤作用的。國外學者 Ralph Hoessel等[3]證實靛玉紅及其衍生物可與ATP結合位點競爭性結合而抑制 CDK等激酶,如 CDK1/cyclin B,CDK2/cyclin A及 CDK2/ cyclin E,其中主要抑制 CDK2,致使L1210細胞株細胞周期 G1/S期和 G2/M期停滯,以及 Jurkat敏感細胞株 G1/S期停滯。此外,Marko等[4]用乳腺癌細胞株實驗證實,靛玉紅及其衍生物可選擇性結合 CDK的ATP結合位點,從而抑制 CDK1/cyclinB結合,誘導乳腺癌細胞的細胞周期 G1/S期和 G2/M期停滯。CDK激酶參予多種人類腫瘤的生長過程,由此推測7-氮雜靛玉紅類衍生物可能有類似的抗腫瘤機理。本課題組將通過體內(nèi)抗腫瘤試驗來進一步探討 7-氮雜靛玉紅類衍生物的作用機制。

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Effects of Eighteen 7-Nitrogen Substituted Indirubin Derivatives on the Proliferation of Six Cancer CellL ines

L IU Ya-bo1,TAO Wen-yi2＊

1School ofM edicine and Phar maceutics,Jiangnan University,W uxi 214122,China;2The Key Laboratory of Industrial B iotechnology,M inistry of Education,Jiangnan University,W uxi 214122,China

Indirubin is an active anticancer component isolated from Qingdai.In this study,effects of eighteen 7-nitrogen substituted derivatives of indirubin on the proliferation of six cancer cell lines were evaluated byMTT assay,and their structure-function relationship was analyzed.After treatment of the cancer cells with compounds 1-18 at concentration range from 1.25 to 20μmol/L for 72 h,growth inhibitory effectswere determined.Results showed that compounds 10-15 with two substitutions,i.e.a N-OH group at the R-position and a bromide or chloride atom replaced H at the R3′-position,could significantly inhibit the proliferation of six human cancer cell lines.However,compounds 1-9 without these substitutions showed relatively lower inhibitory effects.This study suggested that the N-OH group at the R-position and the bromide or chloride atom at the R3′-position might be important for the anti-tumor activities of 7-nitrogen substituted indirubin derivatives.

Qingdai;7-nitrogen substituted indirubin derivatives;indirubin;anti-tumor activity;MTT assay;IC50value

Q946.91;R285

A

1001-6880(2010)05-0899-08

2009-01-15 接受日期:2009-03-30

＊通訊作者 Tel:86-013771028802;E-mail:angel20070611@163.com