黃小瓊，饒子亮，劉盛來，鐘志勇，王 剛，嚴(yán)家榮，陳系古

(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，佛山 528248)

已烯雌酚對免疫性卵巢早衰小鼠卵巢細(xì)胞凋亡的影響

黃小瓊，饒子亮，劉盛來，鐘志勇，王 剛，嚴(yán)家榮，陳系古

(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，佛山 528248)

目的 探討已烯雌酚對免疫性卵巢早衰小鼠卵巢顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞凋亡的影響。方法 以小鼠透明帶3蛋白的第330～342個(gè)氨基酸的序列(NSSSSQFQIHGPR)合成透明帶多肽并作免疫原，免疫SPF級BALB/c雌性小鼠。設(shè)對照、模型和已烯雌酚組。灌胃給藥4周后，采用Tunel方法檢測顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的細(xì)胞凋亡數(shù)并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 已烯雌酚組可顯著減少小鼠卵巢卵母細(xì)胞的凋亡率(P＜0.05)。結(jié)論 已烯雌酚組能改善免疫性卵巢早衰小鼠體重降低癥狀并能誘導(dǎo)發(fā)情。已烯雌酚能改善免疫性卵巢早衰小鼠癥狀的機(jī)制可能是由于能有效地抑制卵母細(xì)胞的凋亡所引起的。

卵巢早衰;已烯雌酚;細(xì)胞凋亡

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指月經(jīng)初潮年齡正?；蚯啻浩谘舆t。第二性征發(fā)育正常的婦女在40歲以前由于卵巢功能衰退而持續(xù)性停經(jīng)并伴有血促性腺激素升高，F(xiàn)SH＞40 IU/L和(或)LH＞30 IU/L，雌二醇減少 (E2＜91.75 pmol/L，至少持續(xù)6個(gè)月)。不僅易出現(xiàn)抑郁、焦慮、敵對、恐懼、人際交往困難等情緒和社交方面的心理衛(wèi)生問題，而且骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、老年性癡呆等疾病的發(fā)生常提前，是一類嚴(yán)重影響婦女生殖健康及身心健康的卵巢功能減退的疾病。作為一類人工合成雌激素藥物，二乙基已烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)被廣泛應(yīng)用于治療卵巢早衰癥。本實(shí)驗(yàn)著重了解已烯雌酚對免疫性卵巢早衰小鼠卵巢顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞凋亡的影響，探討已烯雌酚對免疫性卵巢早衰小鼠癥狀改善作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物來源

BALB/c小鼠，雌性，15～18 g，36 只，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號:2008A023。動物飲水、墊料、籠具均經(jīng)132℃ 10 min高壓蒸汽滅菌，飼料為本中心配制加工的配合顆粒飼料(合格證號2008D007)并經(jīng)121℃ 30 min高壓蒸汽滅菌，水和飼料自由飲食。SPF級BALB/c小鼠飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級實(shí)驗(yàn)動物室，動物實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施合格證號:粵監(jiān)證字2007C099。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及檢測試劑盒

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器:顯微鏡:廠家:OLYMPUS，型號:CX21。電子天平:廠家:上海精密科學(xué)儀器有限公司。型號:YP3001N，精度:0.1 g。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)藥物及檢測試劑:小鼠透明帶多肽(其分析純度＞95%):由杭州中肽生物有限公司提供，批號:CC－11－030。弗氏完全佐劑:Sigma公司產(chǎn)品，批號:038K8726;弗氏不完全佐劑:Sigma公司產(chǎn)品，批號:086K8905。己烯雌酚:合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號:20080104。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒:廠家:Rocho，批號:14492200。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠透明帶多肽溶液的配制:稱取1 mg的透明帶3粉末，加入三蒸水配成0.2 mg/mL的溶液。免疫試劑:將小鼠透明帶多肽溶液和弗氏完全佐劑按照1∶1的比例混合，攪拌30 min，充分混勻。免疫強(qiáng)化試劑:將小鼠透明帶多肽溶液和弗氏不完全佐劑按照 1∶1的比例混合，攪拌 30 min，充分混勻。

1.3.2 小鼠免疫性卵巢早衰模型建立:BALB/c小鼠36只，隨機(jī)分為對照組12只和模型組24只。對照組注射生理鹽水;模型組按文獻(xiàn)方法，以小鼠透明帶3的第330～342個(gè)氨基酸序列(NSSSSQF QIHGPR)所合成透明帶多肽為免疫原，以其免疫SPF級BALB/c雌性小鼠。在足底及腹部皮膚皮下多點(diǎn)注射，每2周1次，共注射3次，第1次加入等量弗氏完全佐劑，第2次和第3次加入等量弗氏不完全佐劑以制備免疫性POF動物模型。造模之日起，每天早上8:00陰道脫落細(xì)胞涂片觀察小鼠動情周期的變化。以出現(xiàn)動情周期紊亂表示造模成功。對動情周期無影響，陰道脫落細(xì)胞涂片顯示卵巢功能未抑制者予以剔除。造模成功后，將BALB/c小鼠隨機(jī)分為模型組、己烯雌酚組，每組12只。對照組和模型組給予生理鹽水，己烯雌酚組按0.15 mg/kg劑量灌胃給藥。均于第三次免疫后開始灌胃，共灌胃4周，每周稱重1次、休息1 d。第3次免疫4周后常規(guī)無菌方法留雙側(cè)卵巢備用，采用Tunel方法檢測顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的細(xì)胞凋亡數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS11.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用組間t檢驗(yàn)，差異顯著性設(shè)為a=0.05。數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)

從首次免疫后至第 25天開始，模型組小鼠表現(xiàn)為易激惹，大便干結(jié)，小鼠逐漸表現(xiàn)為活動頻度減少，對刺激反應(yīng)淡漠，皮毛無光澤。

2.2 已烯雌酚對免疫性卵巢早衰小鼠體重變化情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠在第3周至第8周的體重與對照組比較，顯著性降低體重(P＜0.05)。已烯雌酚組小鼠在第10周的體重與模型組比較，體重顯著增加(P＜0.05)(圖1)。

2.3 已烯雌酚對免疫性卵巢早衰小鼠性周期的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組小鼠進(jìn)行皮下注射后，均行陰道脫落細(xì)胞涂片觀察性周期。模型組動情期不典型，角化細(xì)胞數(shù)減少，與上皮細(xì)胞、白細(xì)胞并見;第35天左右出現(xiàn)動情周期紊亂，動情間期延長，漸至無動情周期，僅為動情間期的白細(xì)胞，時(shí)可見上皮細(xì)胞相混雜。已烯雌酚治療組只見動情期角化細(xì)胞?？瞻讓φ战M有91.7%(11/12)的動物、模型組有16.7%(2/12)的動物仍維持正常的性周期，其余動物均表現(xiàn)為性周期紊亂。已烯雌酚組100%動物均表現(xiàn)為無明顯周期(一直處在動情期)(表1)。

圖1 已烯雌酚對免疫性卵巢早衰小鼠體重的影響Fig.1 The effect of diethylstilbestrol(DES)on the the body weight of mice in immune premature ovarian failure mice

表1 已烯雌酚對免疫性卵巢早衰小鼠性周期的影響(單位:只)Tab.1 The effect of diethylstilbestrol(DES)on the the sexual cycle in immune premature ovarian failure mice(Unit:number)

2.4 已烯雌酚對免疫性卵巢早衰小鼠卵巢細(xì)胞凋亡的影響

Tunnel檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠卵巢中顆粒細(xì)胞的凋亡率與對照組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。已烯雌酚組小鼠卵巢中顆粒細(xì)胞的凋亡率與模型組比較，有所降低，但無顯著性差異(P＞0.05)。模型組小鼠卵母細(xì)胞的凋亡率與對照組比較，具有顯著性差異(P ＜0.05)。已烯雌酚組小鼠卵母細(xì)胞的凋亡率與模型組比較，具有顯著性差異(P ＜0.05)(表2和圖2，見彩插5)。

表2 已烯雌酚對免疫性卵巢早衰小鼠卵巢細(xì)胞的凋亡率影響(±s)Tab.2The effect of diethylstilbestrol(DES)on the the ovary aapoptosis in immune premature ovarian failure mice(±s)

表2 已烯雌酚對免疫性卵巢早衰小鼠卵巢細(xì)胞的凋亡率影響(±s)Tab.2The effect of diethylstilbestrol(DES)on the the ovary aapoptosis in immune premature ovarian failure mice(±s)

注:與對照組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，**P＜0.01。Note:Compared with control group，△△P ＜0.01;compared with model group，**P ＜0.01.

組別Group N卵母細(xì)胞凋亡率Oocyte apoptosis對照組Number顆粒細(xì)胞凋亡率Granulosa cell apoptosis rate Control group 12 5.60±1.94 2.25±0.79模型組 Model group 12 12.42±2.42△△ 7.08±1.65△△已烯雌酚組 DES group 12 9.40±2.96 4.90±0.99**

3 討論

目前，卵巢早衰的發(fā)病率為1.0%～3.8%，患者在40歲之前出現(xiàn)閉經(jīng)、不孕不育、一系列更年期癥狀及老齡化表現(xiàn)，如潮熱、煩躁失眠、陰道干燥等。目前認(rèn)為，在自身免疫性卵巢早衰的發(fā)病機(jī)理、早期診斷方法及新的治療方法等方面，仍有許多需要進(jìn)一步研究之處。本實(shí)驗(yàn)參考朱玲等［1］報(bào)告的造模方法，根據(jù)抗透明帶抗體可以引起自身免疫性卵巢炎，并且可以加速卵母細(xì)胞的破壞和耗竭而致自身免疫性卵巢早衰這個(gè)原理，以卵母細(xì)胞透明帶的片段創(chuàng)新地建立了小鼠的自身免疫性卵巢早衰動物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從第1次免疫后的約第25天開始，模型組小鼠表現(xiàn)為易激惹，大便干結(jié)，動情期不典型，角化細(xì)胞數(shù)減少，與上皮細(xì)胞、白細(xì)胞并見;第35天左右出現(xiàn)動情周期紊亂，動情間期延長，漸至無動情周期 ，僅為動情間期的白細(xì)胞，時(shí)可見上皮細(xì)胞相混雜。小鼠逐漸表現(xiàn)為活動頻度減少，對刺激反應(yīng)淡漠，皮毛無光澤。模型組小鼠在第三周至第八周的體重與對照組比較，差異顯著(P＜0.05)。模型組僅有16.7%(2/12)的動物維持正常的性周期，而空白對照組有91.7%(11/12)的動物維持正常的性周期，結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)所注射透明帶片段有效地影響了卵巢的功能。模型組小鼠卵巢中顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞的凋亡率與對照組比較，差異顯著(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)所注射透明帶片段可能成功誘導(dǎo)了小鼠發(fā)生自身免疫性卵巢炎，導(dǎo)致卵巢細(xì)胞的凋亡。

婦女在絕經(jīng)前，卵巢卵泡的生長發(fā)育在不間斷地進(jìn)行，絕大部分卵泡要在卵泡發(fā)育的不同時(shí)期最終閉鎖消失，僅少數(shù)卵泡發(fā)育成熟、排卵。機(jī)體依靠凋亡控制著卵泡的發(fā)育和閉鎖，使卵巢組織維持一定的成熟卵泡數(shù)，既保證了生殖的需要，又不至于過多排卵。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［2－4］，卵巢早衰婦女卵泡數(shù)量急劇減少，不能分泌足夠的激素及生長因子，卵巢因卵泡數(shù)減少而出現(xiàn)功能衰退伴隨卵巢周期卵泡發(fā)育成熟關(guān)系最密切的是卵巢顆粒細(xì)胞。顆粒細(xì)胞是雌激素、孕激素的重要來源，卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和分化是卵泡不斷發(fā)育至成熟的基本條件，而它的凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的重要且直接的誘導(dǎo)因素。已烯雌酚為人工合成的非甾體雌激素。具有雌激素的一般作用。已烯雌酚應(yīng)用可產(chǎn)生類似青春期的生理變化，可改善如潮熱、煩躁失眠、陰道干燥等卵巢早衰癥狀。本實(shí)驗(yàn)研究表明，已烯雌酚組小鼠卵母細(xì)胞的凋亡率與模型組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，已烯雌酚組小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率與模型組比較，有所降低，但無顯著性差異(P ＞0.05)。根據(jù)李忠香等文獻(xiàn)報(bào)道［5］早期卵泡可能存在不同于晚期卵泡的閉鎖機(jī)制，早期卵泡閉鎖始于卵母細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，隨后累及到顆粒細(xì)胞。晚期卵泡，顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的潛在機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂赡芏鄶?shù)處于早期卵泡。所以出現(xiàn)已烯雌酚不能降低顆粒細(xì)胞的凋亡率的結(jié)果。已烯雌酚組小鼠在第十周的體重與模型組比較，能顯著增加體重(P＜0.05)。100%動物均表現(xiàn)為動情期。結(jié)果提示，已烯雌酚組能改善免疫性卵巢早衰小鼠體重降低癥狀并能誘導(dǎo)發(fā)情，減少動情間期。已烯雌酚能改善免疫性卵巢早衰小鼠癥狀的機(jī)制可能是由于能有效地抑制卵母細(xì)胞的凋亡所引起的。

致謝:衷心感謝廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所李紅梅主任在課題合作研究過程中所給予的指導(dǎo)和支持。

［1］朱玲 ，羅頌平 ，許麗綿，等.左歸丸對免疫性卵巢早衰小鼠抗卵巢抗體的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，15(4):435－437.

［2］張端蓮 ，鄧成國 ，楊虹，等.當(dāng)歸注射液對輻射損傷后小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)雜志，2003，22(12):743－745.

［3］劉潤俠，黨慧敏 ，劉艷巧，等.助孕膠囊對多囊 巢大鼠巢細(xì)胞凋亡的影響［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(5):585－587.

［4］馬曉杋，戴明，吳煥濅，等.針刺對圍產(chǎn)期大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響［J］.中國針灸，2007，25(5):357－361.

［5］李忠香，王自能.生育年齡婦女早期卵泡細(xì)胞凋亡和 Bcl－2/BAX蛋白表達(dá)［J］.中國病理生理雜，2004，20(10):1908－191.

The Effect of Diethylstilbestrol(DES)on the Ovary Apoptosis in Immune Premature Ovarian Failure Mice

HUANG Xiao－qiong，RAO Zi－liang，LIU Sheng－lai，ZHONG Zhi－yong，WANG Gang，YAN Jia－rong，CHEN Xi－gu
(Guangdong Medical Laboratory Animal Center，F(xiàn)oshan 528248，China)

Objective To investigate the influence of diethylstilbestrol(DES)on the apoptosis of ovarian granulosa cells and oocyte in immune premature ovarian failure(POF)mouse.Methods Zona pellucida peptides as immunogens were synthesized according to the No.330～342 amino acid sequence(NSSSSQFQIHGPR)of mouse zona pellucida 3 protein and then was used to immune SPF BALB/c female mouse.Zona pellucida peptides as immunogens，which were synthesized according to the No.330～342 amino acid sequence(NSSSSQFQIHGPR)of mouse zona pellucida 3 protein，was used to immune BALB/c female mouse.And then these mice were divided into three groups as control，model and diethylstilbestrol.Apoptotic granulosa cells and oocyte were detected by Tunel assay after 4 weeks'intragastric administration and the data was statistically analysed.Results In the diethylstilbestrol(DES)group，oocyte apoptosis rate significantly reduced(P＜0.05).Conclusions Diethylstilbestrol(DES)can improve the symptom of weight loss in the immune premature ovarian failure mouse and induce its oestrum.DES may inhibit the apoptosis of oocyte，thereby improving the symptoms of immune premature ovarian failure mice.

Premature ovarian failur;Diethylstilbestrol(DES);Cells apoptosis

R－33

A

1671－7856(2010)06－0039－04

2010－01－07

圖2 已烯雌酚對兔疫性卵巢早衰小鼠卵巢細(xì)胞的凋亡率影響Tunnel檢測圖片
Fig.2 The effect of diethylstilbestrol(DES)on the the ovary apoptosis in immune premature ovarian failure mice

注： A: 空白對照組 400×；B: 模型組 400×；C: 已烯雌酚組 400×
Note: A: blank control group 400×; B: model group 400×; C: DES group 400×

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008A060202002)。

黃小瓊(1973－)，女，獸醫(yī)師，從事實(shí)驗(yàn)動物和比較醫(yī)學(xué)研究工作。

王剛(1966－)，男，高級獸醫(yī)師，從事實(shí)驗(yàn)動物和比較醫(yī)學(xué)研究工作。E－mail:gdmlac@gmail.com