夏機(jī)良，王 濤，季 芳，孫云霄，彭白露，劉曉明，饒軍華

(廣東省昆蟲研究所華南靈長(zhǎng)類研究中心 廣東藍(lán)島生物技術(shù)有限公司，廣州 510555)

巢式PCR檢測(cè)食蟹猴和獼猴中SRV和SFV

夏機(jī)良，王 濤，季 芳，孫云霄，彭白露，劉曉明，饒軍華

(廣東省昆蟲研究所華南靈長(zhǎng)類研究中心 廣東藍(lán)島生物技術(shù)有限公司，廣州 510555)

目的 利用巢式PCR方法檢測(cè)圈養(yǎng)的食蟹猴(Macaca fascicularis)和獼猴(Macaca mulatta)中猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒(Simian Type D Retrovirus SRV)和猴泡沫病毒(Simian foamy virus SFV)。方法 針對(duì)SRV-env和SFV-pol基因的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性外引物，然后再設(shè)計(jì)特異性內(nèi)引物。將外引物擴(kuò)增出的片段克隆到PJET1.2blunt載體中作為陽(yáng)性對(duì)照，運(yùn)用NCBI中BLAST軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果。用巢式PCR方法分別檢測(cè)食蟹猴和獼猴中SRV和SFV。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)食蟹猴中SFV感染率為65.2%，SRV感染率為9.5%，獼猴中SFV感染率為60.5%，SRV感染率為12.8%。結(jié)論 圈養(yǎng)的食蟹猴和獼猴SFV的感染率均較高，SRV感染率很低。

巢式PCR;食蟹猴;獼猴;猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒;猴泡沫病毒

猴 D型逆轉(zhuǎn)錄病毒(simian type D retrovirus，SRV)屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科、D型逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，該病毒主要通過體液傳播，與猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)一樣能導(dǎo)致猴獲得性免疫缺陷綜合癥(simian acquired immunodeficiency syndrome，SAIDS)，由此引發(fā)一些列疾病，包括腹瀉、貧血、體重減輕、脾腫大、淋巴結(jié)病、中性粒細(xì)胞減少癥、表皮纖維瘤和腹膜后纖維瘤等［1］。猴泡沫病毒(Simian foamy virus，SFV)屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科、泡沫病毒屬。SFV在自然界廣泛存在，宿主范圍較廣［2］。已有研究表明該病毒能使細(xì)胞產(chǎn)生空泡狀病變［3］。目前，食蟹猴和獼猴已被廣泛應(yīng)用于病理學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)和藥理學(xué)研究。在研究過程中實(shí)驗(yàn)猴攜帶SRV和SFV會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)由于SRV和SFV的高傳染性，以及SRV的高致病性，對(duì)人和動(dòng)物都有極大危害。因此對(duì)猴體內(nèi)的SRV和SFV進(jìn)行檢測(cè)顯得十分必要。迄今國(guó)內(nèi)還沒有關(guān)于食蟹猴中SRV和SFV的檢測(cè)報(bào)道，獼猴的相關(guān)報(bào)道也不多。本中心現(xiàn)有食蟹猴和獼猴6500多只，最初是來(lái)自于中國(guó)廣西、云南，柬埔寨等地的野生猴，通過人工飼養(yǎng)繁殖后，90%以上自繁實(shí)驗(yàn)猴達(dá)到國(guó)際公認(rèn)的SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，大部分銷往國(guó)內(nèi)外科研機(jī)構(gòu)和醫(yī)藥公司用于科學(xué)研究和藥物評(píng)價(jià)。為了進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)猴的質(zhì)量，我們目前已經(jīng)開展了猴病毒檢測(cè)方法的研究工作［4］。巢式 PCR是一種比較常用的病毒檢測(cè)方法，該方法操作比較簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性好。我們首先建立SRV和SFV巢式PCR檢測(cè)方法，然后運(yùn)用這種方法檢測(cè)食蟹猴和獼猴中SRV和SFV，這些檢測(cè)結(jié)果為我們選取這兩種動(dòng)物進(jìn)行科學(xué)研究提供了背景資料，也有助于我們提前發(fā)現(xiàn)和隔離病毒攜帶猴。

1 材料和方法

1.1 SRV-1感染細(xì)胞系

感染SRV-1的Raji細(xì)胞系，購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 食蟹猴和獼猴外周血取樣及其白細(xì)胞基因組DNA提取

隨機(jī)選取圈養(yǎng)的食蟹猴115只，獼猴78只［生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(粵)2009－0010，使用許可證編號(hào):SYXK(粵)2008－0088］，用5mL的無(wú)菌注射器從食蟹猴和獼猴股靜脈取血1mL，EDTA抗凝。使用通用基因組DNA提取試劑盒，按使用說明提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。

1.3 PCR引物

參照文獻(xiàn)［5，6］針對(duì)SRV-env和SFV-pol基因的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性外引物，然后再設(shè)計(jì)特異性內(nèi)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下:

1.4 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

擴(kuò)增反應(yīng)總體積:16.5 μL水，含 Mg2+的10×buffer、dNTP(2.5mmol/L)各 2.5 μL，正反義引物各 1 μL(10 μmol/L)，DNA 模板 1 μL，Taq 酶(5 U/L)0.5 μL，總體系為 25 μL。在巢式 PCR 過程中，取第一輪 PCR產(chǎn)物 1 μL作為第二輪 PCR模板。PCR反應(yīng)條件為:94℃ 4 min，1個(gè)循環(huán)變性;94℃15 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個(gè) 循 環(huán) 擴(kuò) 增;72℃8 min，1個(gè)循環(huán)延伸;4℃保存。兩輪 PCR反應(yīng)體系和條件相同。PCR完成以后取 PCR產(chǎn)物5 μL，用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(使用Goldview染色)，120 V，20 min。根據(jù) DNA Marker、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照判定結(jié)果。使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.5 陽(yáng)性對(duì)照載體構(gòu)建

使用JPET1.2 blunt作為克隆載體，按說明書進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接子加入到 DH5a感受態(tài)中，混勻，冰浴 30 min，42℃ 熱激 60 s，再次冰浴 3～5 min，然后將感受態(tài)加到LB培養(yǎng)基中，在37℃恒溫?fù)u床中震蕩孵育1～1.5 h，4000 r/min離心3 min，涂板，37℃培養(yǎng)過夜。第2天挑取單克隆，在37℃恒溫?fù)u床中震蕩孵育16 h，收集菌液用堿裂解法提取質(zhì)粒，酶切檢測(cè)，選取酶切正確的質(zhì)粒 DNA進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 食蟹猴和獼猴SRV和SFV的巢式PCR檢測(cè)

以食蟹猴和獼猴外周血白細(xì)胞基因組DNA為模板，以陽(yáng)性載體和水分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。用以上四對(duì)引物進(jìn)行巢式 PCR檢測(cè)SRV和SFV。將PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，出現(xiàn)224 bp條帶的判為SRV陽(yáng)性，出現(xiàn)228 bp條帶的判為SFV陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 SRV和SFV陽(yáng)性載體構(gòu)建

以SRV-1感染Raji細(xì)胞和食蟹猴外周血白細(xì)胞基因組DNA為模板，分別用SRV和SFV的外引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到728 bp和465 bp的目的片段(圖1)。將這兩個(gè)片段與JPET1.2 blunt載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，單菌落培養(yǎng)并提取DNA ，利用 JPET1.2 blunt載體上 XbalⅠ 和 XhoⅠ雙酶切鑒定，雙酶切可同時(shí)將載體上30 bp的序列切下來(lái)，因此雙酶切目的片段應(yīng)該分別為758 bp和495 bp(圖2，3)。挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序，在NCBI網(wǎng)站中通過BLAST軟件分析測(cè)序結(jié)果證實(shí)擴(kuò)增出來(lái)的片段是SRV和SFV中的目的片段。

圖1 SRV和SFV PCR反應(yīng)的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of the PCR about SRV and SFV

2.2 巢式PCR的靈敏度檢測(cè)

將SRV-env-PJET1.2blunt和SFV-pol-PJET1.2blunt載體進(jìn)行10倍梯度稀釋，檢測(cè)巢式PCR的靈敏度。圖3是不同稀釋度陽(yáng)性載體兩輪PCR反應(yīng)的電泳結(jié)果。1～4和 9～12依次是 SRV-env-PJET1.2blunt和 SFV-pol-PJET1.2blunt載體10－1、10－2、10－3、10－4倍稀釋后的第一輪 PCR 擴(kuò)增結(jié)果。5～8和13～16依次是 SRV-env-PJET1.2blunt和 SFV-pol-PJET1.2blunt載體 10－1、10－2、10－3、10－4倍稀釋后二輪PCR結(jié)果。M1和M2均為DNA Marker(DL2000)，17、18是超純水陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)電泳結(jié)果顯示一輪PCR只能檢測(cè)到10－2倍稀釋的樣本，而二輪PCR在樣本稀釋度達(dá)到10－4時(shí)，仍能得到特異性條帶，表明巢式PCR方法的靈敏度是普通PCR的100倍以上。

圖2 雙酶切鑒定SRV-env-PJET1.2blunt和SFV-pol-PJET1.2blunt克隆載體Fig.2 Identification of SRV-env-PJET1.2blunt and SFV-pol-PJET1.2blunt cloned plamids by digestion of double enzymes

圖3 SRV和SFV不同稀釋度的PCR反應(yīng)電泳結(jié)果Fig.3 Results of electrophoresis of PCR with different density SRV and SFV

2.3 巢式PCR的特異性檢測(cè)

使用SRV和 SFV特異性引物，采用巢式 PCR方法對(duì)食蟹猴SRV和SFV進(jìn)行檢測(cè)。圖4電泳結(jié)果顯示SRV和SFV特異性均較好。

2.4 食蟹猴和獼猴全血基因組DNA中SRV和SFV的檢測(cè)

用巢式PCR方法檢測(cè)115只食蟹猴和78只獼猴中SRV和SFV感染情況，部分檢測(cè)重復(fù)3次，結(jié)果一樣，說明巢式PCR方法重復(fù)性較好。檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下:115只食蟹猴中有75只檢測(cè)到了 SFV，11只檢測(cè)到了 SRV。47只獼猴檢測(cè)到了 SFV，10只檢測(cè)到了SRV。結(jié)果表明SFV在食蟹猴和獼猴中感染率較高，分別達(dá)到65.2%和60.2%，SRV在食蟹猴中感染率為9.5%，獼猴中感染率為12.8%。

圖4 食蟹猴SRV和SFV檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of SRV and SFV for Crab-eating Macaque

3 討論

猴是一種很重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用途廣泛，比如猴是常用的動(dòng)物模型，猴可用于生產(chǎn)疫苗，許多生物制品的鑒定都需要上猴體，許多藥物應(yīng)用于臨床之前都需要在猴身上試用。食蟹猴和獼猴是科學(xué)研究中應(yīng)用的比較多的兩個(gè)品種。實(shí)驗(yàn)猴在應(yīng)用于科學(xué)研究之前必須排除一些病毒的感染，主要包括 SIV、SRV、STLV、SFV 等［7］。其中 SRV 可通過體液傳播，可使猴產(chǎn)生獲得性免疫缺陷疾病，并由此產(chǎn)生一些列疾病，對(duì)猴的健康產(chǎn)生嚴(yán)重的危害，還可嚴(yán)重干擾試驗(yàn)結(jié)果。SRV還能感染人，使人產(chǎn)生一系列的疾病。SFV現(xiàn)在已經(jīng)列入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的第二類病毒，為必檢病毒?，F(xiàn)在還沒有研究確定SFV與任何疾病相關(guān)，但是它傳染性強(qiáng)，作為一種逆轉(zhuǎn)錄病毒也必將對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響［8］。因此檢測(cè)猴體內(nèi)SRV和SFV具有重要意義。

病原學(xué)檢測(cè)常用的方法是病毒分離法，但該方法實(shí)驗(yàn)室條件要求高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且無(wú)法檢測(cè)到潛伏期的病毒。巢式PCR方法相對(duì)于傳統(tǒng)的方法靈敏度更高，特異性好，操作簡(jiǎn)單，而且該方法能檢測(cè)出病毒載量很低或處于潛伏期的病毒。本課題首先建立SRV和SFV的巢式PCR檢測(cè)方法，然后利用這種方法檢測(cè)圈養(yǎng)的食蟹猴和獼猴中的SRV和SFV。SRV和SFV巢式PCR方法的建立有助于我們發(fā)現(xiàn)和隔離病毒攜帶猴，為我們進(jìn)一步研制這兩種病毒的巢式PCR檢測(cè)試劑盒打下了基礎(chǔ)。通過檢測(cè)結(jié)果使我們了解了國(guó)內(nèi)食蟹猴和獼猴SRV和SFV的感染情況。這些檢測(cè)結(jié)果還為我們利用這兩種動(dòng)物進(jìn)行科學(xué)研究提供了病毒背景資料。

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Detection of SRV and SFV by Nested PCR for Crab-eating Macaques and Rhesus Macaque

XIA Ji-liang，WANG Tao，JI Fang，SUN Yun-xiao，PENG Bai-lu，LIU Xia-ming，RAO Jun-hua
(Guangdong Entomological Institute Southern China Primate Reseach Center Guangdong Landau Biotechnology Limited Company，Guangzhou 510555，China)

Objective To detect Simian type D retrovirus(SRV)and Simian foamy viruses(SFV)by nested PCR for Crab-eating Macaques and Rhesus Macaque.Methods Two pairs of outside primers were designed according to the conserved env gene of SRV and pol gene of SFV，then the inside primers were also designed.The amplified fragments by outside primers were cloned into PJET1.2 blunt vector.The sequencing results were blasted by blast software of NCBI.With those primers，SRV and SFV were detected by nested PCR in Crab-eating Macaques and Rhesus Macaque.Results The infection rate of SFV and SRV were 65.2%and 9.5%in Crab-eating Macaque.In Rhesus Macaque，the positive rate of SFV and SRV were 60.2%and 12.8%.Conclusion The infection rate of SFV is very high in raising Crab-eating Macaque and Rhesus Macaque，but it is very low for SRV.

NestedPCR;Crab-eatingMacaque;Rhesus Macaque;SimiantypeD retrovirus;Simian foamy viruses

R-332

A

1671-7856(2010)07-0040-04

2010-03-02

廣東省科學(xué)院野外科學(xué)實(shí)驗(yàn)站基金資助項(xiàng)目(sytz2008003)。

夏機(jī)良(1983－)，男，碩士，研究方向:分子生物學(xué)、病毒學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail:jiliangxia2009@163.com

饒軍華，高級(jí)工程師。E-mail:junhuar@tom.com