楊 遜， 陳 鈞*， 韓邦興，2， 趙 磊， 李晨光， 楊 雪

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013;2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安237012;3.江蘇工業(yè)學(xué)院信息科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇常州213164)

水飛薊素(silymarin)系指從菊科植物水飛薊(Silybum marianum L.Gaertn)的種子中提取的一類黃酮木脂素類成分，主要存在于種皮中［1］，具有抗自由基、保護(hù)肝細(xì)胞膜、抗脂質(zhì)過氧化、抗腫瘤、降血脂等藥理作用［2］，對大腦的氧化應(yīng)激［3］及燙傷引起的氧化性皮膚損傷［4］具有保護(hù)作用。水飛薊素難溶于水，因此提高其生物利用度具有重要的臨床意義［5］。為了提高生物利用度，目前水飛薊素的制劑有固體分散體、脂質(zhì)體、磷脂復(fù)合物、羥丙基-β-環(huán)糊精包合物、滴丸等［6］。

固體分散技術(shù)是一種能夠提高難溶性物質(zhì)溶出速率的制劑技術(shù)，其制備方法簡單，但未見水飛薊素固體分散體的藥效學(xué)研究。本試驗旨在將從水飛薊種皮中提取的水飛薊素制備成固體分散體，通過指標(biāo)的測定，考察其對CCl4致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，并與市售的普通片劑進(jìn)行比較。通過Hism函數(shù)，考察各組與空白組間的相似系數(shù)，從整體上考察各組間的差異。

1 儀器、試劑與動物

HH66MC超聲機，無錫超電子設(shè)備廠;DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏試驗設(shè)備有限公司;UV-2550紫外分光光度計，日本島津公司;Z-1智能溶出度儀，天津大學(xué)儀器廠;THZ-C恒溫振蕩儀，江蘇太倉市試驗設(shè)備廠;spectral90型酶標(biāo)儀，美國MD分子儀器公司。

乙酸乙酯、無水乙醇、PVP-K30(聚乙烯吡咯烷酮)，鹽酸(濃度為36.5%)、羥甲基纖維素鈉(CMCNa)，CCl4，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水飛薊賓對照品(批號0856－200203)，購自中國藥品生物制品檢定所;ALT、AST、SOD、MDA測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所;益肝靈(批號:080302，每片重0.18 g，含水飛薊賓38.5 mg)，江蘇中興藥業(yè)有限公司。

pH值為1.2的人工胃液:取稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋至1 000 mL即得;水飛薊種皮:由江蘇中興藥業(yè)有限公司提供。

ICR小鼠，♀♂各半，體重為18～22 g，購于揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號為SCXR(蘇)-2007-0001。試驗前于實驗室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用紫外分光光度法，測定水飛薊素的含量。紫外光譜掃描顯示，PVP的加入不影響水飛薊素的最大吸收波長(287 nm)。精密稱取105℃干燥至恒重的水飛薊賓對照品6.4 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。精密移取0.25、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于 10 mL 量瓶中，分別加水、人工胃液定容至刻度。以A表示吸光度，C表示濃度mg/mL，以水為背景的回歸方程為A=43.821C+0.018 5，R2=0.998 6;以人工胃液為背景的回歸方程為 A=48.651C+0.026 4，R2=0.998 6。

2.2 水飛薊素固體分散體的制備

采用熱回流提取法，以6倍量乙酸乙酯于80℃水浴鍋中連續(xù)提取水飛薊種皮8 h，回收溶劑、烘干、石油醚洗滌，得提取物，UV法測得提取物中水飛薊素的含量為82.15%，HPLC法測得水飛薊賓的含量為36.97%。根據(jù)溶劑法［7］制備固體分散體，按照1∶1、1∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9、1∶11 準(zhǔn)確稱取水飛薊素與PVP，用適量的無水乙醇，超聲溶解，在60℃水浴上揮去溶劑，于60℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干，取出后粉碎過60目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 溶解度試驗

稱取0.5 g水飛薊素及不同比例的水飛薊素-PVP固體分散體，各加入5 mL蒸餾水中，使其呈過飽和狀態(tài)，置37℃恒溫空氣振蕩器中，120 r/min振搖24 h，以4 000 r/min速度離心15 min，取上清液，用0.45μm的微孔濾膜過濾后，于287 nm處測定其紫外吸光度，求其溶解度。

2.4 體外溶出度試驗

試驗方法按照《中華人民共和國藥典》(05版)［8］二部“附錄 XC”規(guī)定，采用第二法(槳法)測定自制水飛薊素及其固體分散體的體外溶出度。以900 mL脫氣后的人工胃液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速(100±1)r/min，水浴溫度為37℃。分別取水飛薊素及其固體分散體(含水飛薊素80 mg)粉末均勻撒入介質(zhì)中，分別于5、10、20、30、45、60、120 min 取樣，每次 5 mL，并補充等體積的釋放介質(zhì)，取樣液用0.45μm的微孔濾膜過濾后，于287 nm處測定其紫外吸光度，求其體外累積溶出率%。

2.5 CCl4致小鼠急性肝損傷模型的建立及動物試驗

ICR小鼠60只，體重為(20±2)g，每組10只，♀♂各半，隨機分為空白組(正常飼養(yǎng)，不做任何處理)、模型組(造模不給藥)、益肝靈低劑量及高劑量組(益低組、益高組)、水飛薊素固體分散體低劑量及高劑量組(固低組、固高組)，共6組。

益肝靈說明書可知，成人用量為每日231 mg水飛薊賓，根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》中劑量的換算［9］，并按照不同給藥劑量的動物試驗中片劑與固體分散體水飛薊賓的給藥量各自相等的原則，確定試驗小鼠水飛薊賓的灌胃量:低劑量組為30 mg/kg，高劑量組為120 mg/kg。用0.5%的CMC-Na分別溶解益肝靈及固體分散體，配制好相應(yīng)的濃度后，各組按10 mL/kg灌胃給藥，空白組和模型組灌服相應(yīng)劑量的0.5%CMC-Na，每日1次，連續(xù)6 d，第6天灌胃后2 h后，除空白組，每組小鼠按10 mL/kg注射含0.1%CCl4的大豆色拉油溶液，同時禁食不禁水。

2.6 指標(biāo)的測定

造模20 h后，小鼠眼眶取血，分離血清，測定ALT及AST活力。小鼠處死后，取小鼠肝稱重并計算肝系數(shù)(肝臟濕重與體重之比)。同時，制備10%的肝勻漿，測定肝勻漿MDA及SOD。以上指標(biāo)均按試劑盒操作說明測定。

2.7 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 水飛薊素固體分散體的溶解及溶出特性研究

3.1.1 溶解度試驗結(jié)果

水飛薊素在水中的溶解度為0.145 mg/mL。由圖1可知，隨著水飛薊素固體分散體中PVP的增加，水飛薊素在水中的溶解度逐漸增加。當(dāng)比例為1∶5、1∶7、1∶9、1 ∶11 時，固體分散體的溶解度分別是水飛薊素溶解度的36、62、64和90倍，由此可見，輔料PVP顯著增加水飛薊素在水中的溶解度。

圖1 水飛薊素-PVP固體分散體在水中的溶解度

3.1.2 體外溶出度試驗結(jié)果

由圖2可知，當(dāng)無PVP加入時，水飛薊素在介質(zhì)的溶出速率和溶出度都較低，120 min過后只有20%左右。載體PVP的加入，使溶出的速率和程度都有不同程度的提高，但1∶7與1∶9的固體分散體體外溶出度相差不大。而當(dāng)水飛薊素與PVP比例為1∶7時，溶解度同樣得到顯著提高，為了控制PVP的用量，選擇此比例進(jìn)行小鼠試驗。

圖2 水飛薊素-PVP固體分散體的累積溶出曲線

3.2 固體分散體對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

3.2.1 指標(biāo)的測定結(jié)果

各組小鼠分別進(jìn)行五個指標(biāo)的測定，見表1。結(jié)果可知，模型組與空白組均有極顯著差異(P<0.01)，說明造模成功。

肝系數(shù)測定結(jié)果中，各用藥組與模型組均有顯著性差異(P<0.05)，說明水飛薊素能夠有效的改善CCl4引起的小鼠肝臟腫大;益低組、益高組、固低組的ALT與模型組無明顯差異，其改善指標(biāo)ALT作用不強，但固高組與模型組存在極顯著性差異(P<0.01)，且固高組與益高組之間存在極顯著性差異(P<0.01)，可知固體分散體效果強于片劑益肝靈;除益低組，其它各治療組的AST與模型組均存在顯著差異(P<0.05，P<0.01)，且固體分散體與相應(yīng)劑量的益肝靈相比差異顯著(P<0.05)。

SOD與MDA測定結(jié)果顯示，治療組不同程度使降低的SOD值升高、使升高的MDA值降低，且固體分散體對MDA的影響程度明顯高于益肝靈(P<0.05，P<0.01)。

3.2.2 各組與空白組間的綜合分析

表1 固體分散體對小鼠肝系數(shù)、ALT、AST、SOD、MDA的影響(±s)

表1 固體分散體對小鼠肝系數(shù)、ALT、AST、SOD、MDA的影響(±s)

注:與空白組相比，☆☆P<0.01;與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01;與相應(yīng)劑量的陽性對照藥益肝靈相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組別 水飛薊賓劑量/(mg/kg)肝系數(shù)/%ALT/(U/L)AST/(U/L)SOD/(U/mgprot)MDA/(nmol/mgprot)空白組 — 4.85±0.06 27.10±2.26 58.57±4.84 149.41±3.01 3.47±0.45模型組 — 6.18±0.09☆☆ 124.65±3.85☆☆ 174.22±6.61☆☆ 82.73±3.46☆☆ 6.09±0.21☆☆益低組 30 5.37±0.08△ 111.93±9.30 154.4±12.64 97.57±4.45△△ 4.51±0.43△△益高組 120 5.20±0.11△ 102.37±4.97 149.06±6.98△ 103.19±1.32△△ 3.64±0.26△△固低組 30 5.22±0.05△ 103.25±15.1 128.10±7.25△△▲ 113.53±6.11△△ 3.80±0.39△△▲固高組 120 4.98±0.12△ 50.89±14.03△△▲▲ 70.46±10.50△△▲ 143.59±7.14△△ 3.08±0.18△△▲▲

由以上5個指標(biāo)的測定可知，治療組對各指標(biāo)均有改善作用，但各個治療組對不同指標(biāo)的影響程度不相同，為了充分比較固體分散體與片劑益肝靈之間的差異，進(jìn)一步從整體上進(jìn)行分析。

設(shè) X=(x1，…，xd)和 Y=(y1，…，yd)是 d 維空間中的兩個點，相似性度量函數(shù)如下［10］:

取表1中各個指標(biāo)的平均值構(gòu)成6×5的矩陣，將每兩組5個指標(biāo)的數(shù)值分別代入Hism函數(shù)進(jìn)行計算，求出組間相似系數(shù)。試驗中，d(d=5)為指標(biāo)個數(shù)，xi、yi為所比較的兩組(X與Y)中第i個指標(biāo)的平均值。Hism函數(shù)描述多維空間中兩點的接近程度，當(dāng)兩點完全重合時，函數(shù)值為1;當(dāng)兩點無限遠(yuǎn)離時，函數(shù)值為0。當(dāng)以空白組為比較基準(zhǔn)時，該函數(shù)值越大，表示被比較組的數(shù)據(jù)總體上越接近空白組，即治療效果越好。

由表2可知，各試驗組與空白組之間的相似系數(shù)由大到小依次是:固高組，益高組，固低組，益低組，模型組，其中固高組與空白組最接近，說明固體分散體的效果明顯優(yōu)于片劑，且一定范圍內(nèi)的高劑量優(yōu)于低劑量。

表中固高組和益高組與空白組之間的相似系數(shù)之差為0.043 2，而固低組與益低組與空白組之間的相似系數(shù)之差為0.070 7，說明低劑量時改變藥物的劑型，對于藥效的提高更有效。

表2 各組與空白組之間的Hism函數(shù)相似系數(shù)

4 討論

固體分散體是一種難溶性藥物以分子、膠態(tài)、微晶或無定形態(tài)，分散于另一種水溶性材料中的技術(shù)，本文通過對不同比例水飛薊素-PVP固體分散體的溶解度及體外溶出度的考察，說明PVP為一種提高水飛薊素溶解度與溶出度的良好載體。從經(jīng)濟(jì)與實用的角度出發(fā)，最終選擇以水飛薊素與載體PVP比例為1∶7的固體分散體，作為小鼠急性肝損傷試驗中的供試藥。

CCl4在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)細(xì)胞色素P450依賴性混合功能氧化酶的代謝，生成活潑的三氯甲基自由基和氯自由基。這些自由基可與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜的大分子發(fā)生共價結(jié)合，使酶的功能喪失，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，胞漿Ca2+濃度升高，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷壞死，胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶滲入血液。試驗中，利用CCl4致肝損傷模型中指標(biāo)的測定，證明給藥組對各指標(biāo)都有不同程度的改善作用，固體分散體對一些指標(biāo)的效果明顯優(yōu)于片劑。這與以往水飛薊素對于脂質(zhì)過氧化作用的對抗作用相一致，且本文將藥劑學(xué)的藥物體外理化性質(zhì)的改變應(yīng)用于藥效研究，體內(nèi)外的結(jié)合更加說明提高溶解度和體外溶出度對于治療效果的影響不容忽視，這可能與藥物的生物利用度得到提高有關(guān)。

Hism函數(shù)是一種新的高維數(shù)據(jù)距離函數(shù)或相似度量函數(shù)，它的優(yōu)點在于在該函數(shù)中占主導(dǎo)地位的是那些X和Y在其上差別較小(非?？拷?的維。只要在某些維上X和Y的數(shù)值比較接近，就會表現(xiàn)出一定的相似性［10］。為了綜合五個指標(biāo)同時考慮制劑對小鼠的影響作用，本文首次利用此函數(shù)對試驗所得各組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，得到各組與空白組之間的相似系數(shù)，這與預(yù)期效果相吻合。結(jié)合多個指標(biāo)，用此法判斷藥物對癥狀的總體影響較為全面、具體和直觀。

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