朱社敏，王 丹，楊 珉，何忠平，匡 榮

(1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)所，杭州 310004;2.金華市藥品檢驗(yàn)所，金華 321000)

浙江省熱原檢查用兔敏感性狀況調(diào)查

朱社敏1，王 丹1，楊 珉1，何忠平2，匡 榮1

(1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)所，杭州 310004;2.金華市藥品檢驗(yàn)所，金華 321000)

目的 調(diào)查浙江省熱原檢查用兔對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性情況，為提高熱原檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供參考。方法 對(duì)全省所有取得生產(chǎn)許可證單位的家兔，用國家頒發(fā)的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，“熱原檢查法”進(jìn)行檢查，劑量分別為5 EU/Kg和10 EU/Kg，記錄并比較各單位家兔的平均升溫值和升溫率。結(jié)果 對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素，各兔場家兔的敏感性有一定的差異。靜脈注射5 EU/kg，平均升溫值為0.40℃～0.87℃，升溫率為35%～83%;靜脈注射10 EU/kg，平均升溫值為0.74℃～1.16℃，升溫率為70%～94%。結(jié)論 不同生產(chǎn)單位的家兔對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性不同，有必要對(duì)熱原檢查用家兔進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素敏感性檢查。

熱原;家兔;敏感性;細(xì)菌內(nèi)毒素

熱原檢查法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。雖然熱原檢查是最接近臨床的，但影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素很多［1］。早期由于對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、飼養(yǎng)條件沒有統(tǒng)一要求，影響因素主要集中在動(dòng)物的管理、實(shí)驗(yàn)環(huán)境等方面，隨著飼養(yǎng)條件、實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求的逐步提高，管理的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，有許多影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素已可以被排除，如飼養(yǎng)方式、飼料、檢查前動(dòng)物的禁食情況、實(shí)驗(yàn)環(huán)境等。但有些因素仍然存在，其中最主要的就是家兔的敏感性問題，因此，我們對(duì)浙江省取得家兔生產(chǎn)許可證的5家家兔繁殖場的家兔用細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行了敏感性測定。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

家兔(新西蘭)，等級(jí):普通級(jí)，體重 1.7～2.5 kg，雌雄各半，飼養(yǎng)條件:溫度 21℃～24℃，濕度40%～70%，飼養(yǎng)條件、實(shí)驗(yàn)條件均滿足《中國藥典》2005年版二部附錄［2］要求。動(dòng)物 1只/籠飼養(yǎng)于不銹鋼實(shí)驗(yàn)籠RB35型(長×寬×高:350mm×500mm×320mm)中;三層擺放，每層5個(gè)兔籠。不限量自由攝取水和食物。正式實(shí)驗(yàn)前一小時(shí)開始禁食、禁水，實(shí)驗(yàn)過程中不進(jìn)食、進(jìn)水。兔場生產(chǎn)許可證號(hào)分別為:SCXK(浙)2006－0024;SCXK(浙)2006－0025;SCXK(浙)2006－0026;SCXK(浙)2008－0036;SCXK(浙)2009－0039。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

1.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品:批號(hào):981，規(guī)格:9000單位/支，中國生物制品檢定所。臨用時(shí)，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配成5 EU/mL的溶液。根據(jù)給藥劑量要求，分別給藥1mL/kg(5 EU/kg)或2mL/kg(10 EU/kg)。

1.2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水:批號(hào):0807090，規(guī)格:100mL/瓶，湛江安度斯生物試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

熱原測溫儀:ZRY－2D型智能熱原測定儀(天津天大天發(fā)科技儀器有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與方法

實(shí)驗(yàn)用家兔購入后，在相同環(huán)境下飼養(yǎng)5～7 d，按《中國藥典》2005年版二部附錄“熱原檢查法”進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，按熱原檢查兔使用標(biāo)準(zhǔn)判斷家兔是否符合試驗(yàn)的要求。對(duì)首次測試不合格的家兔，休息2～3 d后，再次進(jìn)行測試。在新兔選擇后2～5 d，按“熱原檢查法”中熱原檢查程序，以注射細(xì)菌內(nèi)毒素前所測得2次體溫的平均值為基礎(chǔ)體溫，進(jìn)行家兔基礎(chǔ)體溫測定。每個(gè)兔場取基礎(chǔ)體溫符合試驗(yàn)要求的家兔36～40只，按性別隨機(jī)分成雌雄各2組，每組8～10只，經(jīng)家兔耳緣靜脈注射細(xì)菌內(nèi)毒素，劑量分別為按體重給予細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品5 EU/kg或10 EU/kg，注射后，按照熱原檢查要求繼續(xù)家兔體溫測試，每30 min測試一次，共測溫6次，測溫結(jié)束后，以給藥后動(dòng)物最高升溫值為該兔最大升溫值，計(jì)算各組家兔的平均最大升溫值(均溫)，沒有升溫只有降溫的均以0計(jì);以最大升溫值≥0.6℃的家兔為升溫兔，統(tǒng)計(jì)各單位升溫動(dòng)物數(shù)并計(jì)算升溫動(dòng)物數(shù)的百分率(升溫率)。除兔場1外，所有實(shí)驗(yàn)均由相同人員在相同環(huán)境中進(jìn)行，兔場1由相同人員在兔場1實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料分析采用DAS統(tǒng)計(jì)軟件中多組均數(shù)分析法進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料分析采用DAS統(tǒng)計(jì)軟件中智能化兩組有效率分析法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 不同來源家兔新兔合格率測試

不同來源家兔新兔測試合格率不同，首次測試合格率和總合格率的差異均 顯著(P＜0.05或P＜0.01)，重復(fù)測試可提高家兔的合格率(表1)。

表1 不同來源家兔新兔合格率測試結(jié)果Tab.1 Testing results of qualification rate of rabbits from different farms

2.2 不同來源家兔基礎(chǔ)體溫的測試

有文獻(xiàn)報(bào)道，家兔基礎(chǔ)體溫與熱原的敏感性有關(guān)，兔溫低的較為敏感，兔溫高的較為不敏感［3］。測試結(jié)果表明，各兔場的基礎(chǔ)體溫雖有一定的差異，但主要都分布在38.4℃～39.0℃(表2)。

表2 不同來源家兔基礎(chǔ)體溫測試結(jié)果Tab.2 Testing results of basal body temperature of rabbits from different farms

2.3 家兔靜脈注射5 EU/kg細(xì)菌內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

靜脈注射5 EU/kg細(xì)菌內(nèi)毒素后，動(dòng)物總體的平均最大升溫值為0.58℃，升溫率為53%。各兔場家兔的平均最大升溫值和升溫率均存在有顯著性意義的差異(P＜0.05或P＜0.01)。其中兔場1最敏感，平均升溫值達(dá)0.87℃，升溫率為83%，而最低的兔場 2，平均升溫值只有 0.40℃，升溫率僅為35%(表3)。

2.4 家兔靜脈注射10 EU/kg細(xì)菌內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

靜脈注射10 EU/kg細(xì)菌內(nèi)毒素后，動(dòng)物總體的平均最大升溫值為0.91℃，升溫率為82%。各兔場家兔的平均最大升溫值仍存在顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。但升溫率除兔場1與兔場2的雄性兔仍存在顯著性差異(P＜0.05)，其余的差異均不顯著(P＞0.05)(表4)。

3 討論

家兔熱原檢查法自1912年首次提出，1923～1925年得到發(fā)展。1942年美國藥典首次收載了熱原試驗(yàn)(pyrogen test)，將熱原試驗(yàn)作為檢查藥品注射液的發(fā)熱物質(zhì)，其后各國藥典也均收載了這一方法，成為經(jīng)典的熱原檢查法。同樣，1953年第一版《中國藥典》中就收載了熱原檢查法，半個(gè)多世紀(jì)以來，熱原檢查法作為一種質(zhì)控的重要手段，為保障人民用藥安全作出了極大的貢獻(xiàn)。

表3 不同來源家兔靜脈注射5EU/kg細(xì)菌內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Testing results of body temperature of rabbits injected intravenously with endotoxin at 5 EU/kg body weight from different farms

表4 不同來源家兔靜脈注射10EU/kg細(xì)菌內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Testing results of body temperature of rabbits injected intravenously with endotoxin at 10 EU/kg body weight from different farms

不同品種、來源的家兔對(duì)熱原的敏感性不同;即使是同一品種、同一來源的家兔，經(jīng)不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位自繁自育后，也可能會(huì)對(duì)熱原的敏感性不同［1］。目前，浙江省內(nèi)熱原檢查使用的家兔品種主要為新西蘭種，種群主要來源于上海，經(jīng)過各兔場的自繁自育后，熱原的敏感性呈現(xiàn)出較大的差異，這是因?yàn)槟壳案鲗?shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位基本上均為封閉式管理，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位間的交流較少，而各單位選擇自繁母兔的方法也不一致。以兔場1為例，兔場1系一小型的家兔養(yǎng)殖場，自繁自育生產(chǎn)的家兔，從不對(duì)外供應(yīng)，僅用于本單位的熱原檢查。飼養(yǎng)條件相對(duì)穩(wěn)定、人員管理比較規(guī)范，在選擇母兔時(shí)，特別注重基礎(chǔ)體溫的范圍及波動(dòng)情況;品種的純度相對(duì)較高，因此該單位家兔的新兔合格率及對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性都保持了較高的水平。

不同單位生產(chǎn)的家兔對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性不同，受基礎(chǔ)體溫影響較小。基礎(chǔ)體溫偏高的家兔并非對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素敏感性最差，而敏感性最差單位的家兔基礎(chǔ)體溫，如兔場2、3，其基礎(chǔ)體溫基本都在38.0℃～39.0℃之間。

不同家兔性別對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性可能不同［4］，但性別的影響更取決于家兔的來源。對(duì)兔場2來說，雌性家兔的敏感性明顯高于雄性，而對(duì)兔場3來說，正好相反，雄性家兔的敏感性明顯高于雌性。

藥品注射劑的熱原檢查，是保證靜脈注射藥品安全的重要檢查項(xiàng)目之一，其結(jié)果的準(zhǔn)確與否，直接關(guān)系到臨床的用藥安全。家兔對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性直接決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于各單位使用家兔的來源不同，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性不一致，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致。使用高敏感性的家兔，可以更好的保障人民用藥的安全，但有時(shí)也會(huì)帶來一定的麻煩:兔場1就遇到過本單位檢查不合格，復(fù)核單位檢查合格的尷尬事件。而家兔對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性過低，將直接造成“假陰性”的結(jié)果，將失去熱原檢查的保障作用，嚴(yán)重影響人民的用藥安全。因此，建議盡早建立熱原用兔細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性檢查方法，并對(duì)全國各熱原用兔提供單位的家兔實(shí)施檢查，以提高熱原檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。各熱原用兔提供單位，應(yīng)重視實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量，規(guī)范繁育方法，淘汰敏感性低的家兔，以保證熱原實(shí)驗(yàn)用兔對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性。

［1］徐長金.影響家兔法檢查熱原的諸因素［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，1985，5(8):27－28.

［2］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(2005版)［S］.2005.二部附錄.

［3］李成章.熱原檢查中某些影響因素的探討［J］.藥學(xué)通報(bào)，1982，17(8):11－12.

［4］徐文瑜，任珺，杜穎，等，家兔性別與體溫變化對(duì)熱原檢測結(jié)果的影響［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，2006，23(3):22－25.

Investigation of the Sensitivity of the Rabbits for Testing Pyrogen in Zhejiang Province

ZHU She－min1，WANG Dan1，YANG Min1，HE Zhong－pin2，KUANG Rong1
(1.Zhejiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 310004，China;2.Jinhua Institute for Drug Control，Jinhua 321000，China)

Objective To investigate the sensitivity to bacterial endotoxin of the rabbits for testing pyrogen(RTP)in Zhejiang province.Methods The rabbits from all the farms that obtained production license in Zhejiang province were administrated with two doses of endotoxin(5 EU/kg and 10 EU/kg).The average value and percentage of temperature elevated of the rabbits from different farms were recorded and compared in the pyrogen test.Results There were some differences on the sensitivity of RTP to bacterial endotoxin form different farms.When the rabbits were injected the endotoxin intravenously of 5 EU/kg or 10 EU/kg respectively，the average value of temperature were 0.40℃～0.87℃ or 0.74℃～1.16℃ and the percentage of temperature elevated were 35%～83%and 70%～94%.Conclusion Different rabbits from different farms show different sensitivity to bacterial endotoxin.It is necessary to test the sensitivity of RTP to bacterial endotoxin.

Pyrogen;Rabbits;Sensitivity;Bacterial endotoxin

R332

A

1671－7856(2010)07－0086－05

2010－03－02

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目 (NO.2008F80023)。

朱社敏，女，主任藥師，研究方向:藥檢藥理。E－mail:CNCZSM@126.com

匡榮，副主任藥師，研究方向:藥檢藥理。E－mail:kuangrongyjs@hotmail.com