區(qū)偉佳，王 榮，李敏清，袁英英，李華興

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642）

華南地區(qū)大豆根內(nèi)拮抗菌AF-67篩選與鑒定*

區(qū)偉佳，王 榮，李敏清，袁英英，李華興**

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642）

篩選生防菌共436株，有生防性能71株，占16.3%，抑菌效果較好8株，占1.8%，能快速高命中率的獲得具有防病效果好、抑菌譜廣的生防菌株。內(nèi)生菌AF-67與Fusarium oxysporum共培養(yǎng)時(shí)，能使其菌絲體及其分生孢子生長(zhǎng)明顯畸變。經(jīng)16S rDNA基因序列分析，AF-67被初步鑒定為Bacillus amyloliquefaciens。

大豆根腐??；根內(nèi)拮抗菌；篩選；鑒定；16S rDNA

大豆根腐病(Soybean root rot)在國(guó)內(nèi)外大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，是土傳病害，危害較重[1]。該病對(duì)產(chǎn)量影響大，感病品種產(chǎn)量損失一般為5%～10%，嚴(yán)重的可達(dá)90%以上，甚至絕產(chǎn)。每年給國(guó)家造成巨額經(jīng)濟(jì)損失[2,3]。華南大豆產(chǎn)區(qū)高溫多雨的氣候環(huán)境，土壤緊實(shí)粘重、偏酸等均有利于根腐病的發(fā)生[4]，關(guān)于解決華南產(chǎn)區(qū)大豆根腐病的研究越來越受科研工作者的關(guān)注。

生物防治手段普遍應(yīng)用于植物病害防治。許多根際或根內(nèi)微生物同時(shí)具有防病、促生作用。土壤施用含有該生防菌株的生物肥料能減少農(nóng)藥的用量，降低成本，同時(shí)還能改善土壤條件及農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)[5]。在生防菌株的篩選源上，考慮生防菌在植株根部的定殖效果，著重研究從植株根際或根內(nèi)中篩選。有研究表明，從根際或根內(nèi)分離篩選出的拮抗菌能更好的定殖在植株根系[6,7]。

芽孢桿菌作為目標(biāo)菌群，更能適合于生物肥料工業(yè)生產(chǎn)的要求。研究通過對(duì)有效生防菌的16S rDNA序列分析，確定生防菌的種類和來源。旨在提供一種快速、準(zhǔn)確的生防菌選鑒方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌分離材料

采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博羅、寧西大豆試驗(yàn)田的大豆植株。

1.2 供試大豆根腐病原菌

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum） 3個(gè)高致病性菌株 F1、F2、F5；

絲核菌（Rhizoctoniasp）；

小核菌(Sclerotium rolfssii)；

以上供試菌種由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院根系中心分離與提供。

1.3 根內(nèi)拮抗芽孢桿菌AF-67的分離

選取健康強(qiáng)壯大豆植株根系，表面消毒后，無(wú)菌狀態(tài)置于滅菌研缽，加入適量LB培養(yǎng)基和滅菌石英砂，充分研磨后轉(zhuǎn)入含50mL LB液體培養(yǎng)基中，150rpm富集培養(yǎng)30min。取出，置于80℃恒溫水浴10min。培養(yǎng)液稀釋后，取適當(dāng)濃度涂布LB平板，36℃培養(yǎng)48h后挑取形態(tài)不同、長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落，劃線純化。

1.4 拮抗菌篩選、抑菌效果與菌間相容性測(cè)定 [8,9]

距PDA平板中心3cm處互相垂直四個(gè)方向點(diǎn)接拮抗細(xì)菌，平板的中央接種經(jīng)過活化的尖孢鐮刀菌菌塊(直徑5mm)，28℃黑暗培養(yǎng)12d后記錄菌圈直徑，設(shè)5個(gè)重復(fù)。公式如下：

同時(shí)按上述的方法對(duì)絲核菌、小核菌進(jìn)行拮抗性測(cè)定。

菌間相容性采用交叉劃線法：取待檢拮抗菌液依次兩兩交叉劃線，在劃線的交叉處出現(xiàn)透明不生長(zhǎng)，為菌間不相容；無(wú)出現(xiàn)透明點(diǎn)，能正常生長(zhǎng)為菌間相容[8，9]。

1.5 拮抗菌AF-67的鑒定

形態(tài)鑒定參照《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[10]；AF-67鑒定方法采用分子生物學(xué)16S rDNA序列分析：取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期菌液，用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取AF-67的總DNA。配制擴(kuò)增體系50uL，其中，正向引物K01(FC27):5’AGAGTTTGATCCTGGCTCA G 3’；反向引物K02(RC1492):5’TACGGCTACCTT GTTACGACTT 3’。PCR產(chǎn)物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。序列結(jié)果通過BLASTN程序在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析，確定其分類地位。

1.6 AF-67培養(yǎng)液對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲發(fā)育影響

將尖孢鐮刀菌（F5） 菌塊(直徑5mm)與AF-67菌懸液3mL加入50mLKB培養(yǎng)液中，28℃，150rpm培養(yǎng)3d。吸取少量培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察真菌菌絲的生長(zhǎng)情況。對(duì)照接病原菌塊的KB培養(yǎng)液。

2 結(jié)果和討論

2.1 大豆根內(nèi)拮抗菌分離與篩選

從大豆根內(nèi)篩選出候選生防菌共436株，其中具有生防性能71株，占16.3%，其中對(duì)大豆根腐病原菌具明顯抑制作用8株，占1.8%，抑菌效果見表1。

試驗(yàn)證明該法能高命中率的獲得具有防病效果好、抑菌譜廣的生防菌株。由表1可知，所得菌株對(duì)峙試驗(yàn)后15d仍保持高抑菌效果性能。

表1 生防菌對(duì)大豆根腐病菌抑菌效果 %

2.2 生防菌相容性測(cè)定

生防菌間相容性測(cè)試結(jié)果顯示（見表2），菌株AF8與其他大部分生防菌顯示不相容性，其他菌株均顯示可以共存。

表2 生防菌間相容性測(cè)試結(jié)果

2.3 拮抗菌AF-67的16S rDNA分子生物學(xué)鑒定

圖1 拮抗菌AF-67的16S rDNA電泳條帶及其測(cè)序峰圖片段

優(yōu)選有代表性，編號(hào)為AF-67拮抗細(xì)菌，16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果經(jīng)GenBank(NCBI)比對(duì)，登記號(hào)為lcl58891。根據(jù)同源性比較（見表3），與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis subsp） 同源性最高，達(dá)99%，與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢桿菌 （Bacillus pumilus） 同源性也達(dá)97%。

表3 AF-67 16S rDNA在GenBank(NCBI)比對(duì)結(jié)果

拮抗菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增條帶單一、清晰，位于約1.5kb處。其序列峰圖效果理想，無(wú)出現(xiàn)錯(cuò)峰套峰，測(cè)序結(jié)果可靠性高（見圖1）。

測(cè)序結(jié)果在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2），分析遺傳距離，其種間親緣關(guān)系表明AF-67與B.Amyloliquefaciens的親緣關(guān)系最近，且在同一個(gè)分支中，這再次驗(yàn)證了AF-67最可能為解淀粉芽孢桿菌。

2.4 AF-67對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲發(fā)育影響

拮抗菌AF-67與鐮刀菌共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，能明顯抑制病菌菌絲的生長(zhǎng)（見圖3）。菌絲體局部明顯膨大、腫脹，菌絲不發(fā)育，同時(shí)有畸形、斷裂現(xiàn)象，菌絲體分隔數(shù)顯著增多。細(xì)胞內(nèi)含物大量凝聚，部分形成大且透明的空泡。與對(duì)照相比，經(jīng)共培養(yǎng)的鐮刀菌產(chǎn)孢量明顯減少。

圖2 AF-67的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 AF-67對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲發(fā)育影響

3 討論

鑒于芽孢桿菌屬的生物安全性、耐熱特性和生產(chǎn)上的可操作性，試驗(yàn)?zāi)芸焖僦苯雍Y選出目標(biāo)生防菌。結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)于難于培養(yǎng)、生化反應(yīng)不明顯及遺傳表型等手段不能鑒定的細(xì)菌，采用此法提供快捷可行的解決方案。

造成大豆根腐的致病菌種類繁多雜亂，地域差異性大[11]。篩選的8株生防菌對(duì)幾種華南地區(qū)的常見致病菌均顯示較好抑菌效果。靶標(biāo)菌中，國(guó)內(nèi)以Fusarium oxysporum的出現(xiàn)頻率最多[12，13]，大豆項(xiàng)目科研基地的感病植株，其5號(hào)高致病性菌株的分離率最高。篩選的AF-67對(duì)Fusarium oxysporum菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制作用，具開發(fā)利用潛力。

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In this study,the improved traditional screening methods could quickly obtain strains which showed antagonistic activity against soybean root rot and broad antagonistic spectrum.The activity of 436 strains assayed，16.3%of them showed antagonistic activity againstF.oxysporumf.sp.soybean and one of them,strain AF67 isolated from soybean roots was the best.Co-culture with Fusarium oxysporum,mycelium and conidia were evident distortion.Based on the sequence of 16S rDNA,strain AF67 was identified asBacillusamyloliquefaciens.

Soybean root rot;Antifungal Entophytic Bacteria;Isolation;Characterization;16S rDNA

S432.4+4

B

1674-3547(2010)02-0018-04

2009-12-22；修回日期：2010-01-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（40971155）；廣東省“十一五”攻關(guān)項(xiàng)目（2006B20301050），廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（2009B090300330），廣東省農(nóng)業(yè)廳科技項(xiàng)目（粵農(nóng)土肥（2004）28號(hào)）。

李華興，男，教授，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，E-mail:huaxli@scau.edu.cn