高海霞, 侯旭光, 祝 茜,2

（1. 山東大學(xué) 威海分校 海洋學(xué)院, 山東 威海 264209; 2. 國家海洋局 第三海洋研究所, 福建 廈門 361005）

黑足鮑COⅠ基因序列在遺傳分析中的初步研究

高海霞1, 侯旭光1, 祝 茜1,2

（1. 山東大學(xué) 威海分校 海洋學(xué)院, 山東 威海 264209; 2. 國家海洋局 第三海洋研究所, 福建 廈門 361005）

對引自新西蘭的黑足鮑（Haliotis iris）的線粒體DNA 13個(gè)蛋白基因之一細(xì)胞色素C氧化酶亞基基因進(jìn)行了特異性擴(kuò)增和測序, 并分析了524 bp的堿基序列。結(jié)果顯示, 在37個(gè)野生個(gè)體的基因序列中檢測到3個(gè)變異位點(diǎn), 定義了3個(gè)單倍型, 個(gè)體間序列差異很小。單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）分別為0.249和0.000 79, 遺傳多樣性水平很低。在以貽貝（Mytilus edulis）為外群構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上, 黑足鮑處于相對適中的位置。本次研究以期為了解黑足鮑的遺傳學(xué)背景提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)為鮑COⅠ基因的研究提供資料。

黑足鮑（Haliotis iris）; COⅠ; 遺傳多樣性; 系統(tǒng)發(fā)育

黑足鮑（Haliotis iris）屬軟體動(dòng)物門（Mollusca）,腹足綱（Gastropoda）, 前鰓亞綱（Prosobranchia）, 原始腹足目（Archaeogastropoda）, 鮑科（Haliotidae）。分布于太平洋西南部大洋洲沿岸, 主要分布于新西蘭的部分島礁周圍海域。外殼常被作為漂亮的工藝品出售, 并在國際市場上很受歡迎[1], 是一種具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鮑。繼紅鮑（H. rufescens）、綠鮑（H. fulgens）、西式鮑（H. sieboldii）的引進(jìn)之后[2], 黑足鮑亦被引入國內(nèi)養(yǎng)殖。各種鮑的相繼引進(jìn)雖然豐富了我國鮑的養(yǎng)殖品種, 但也存在對本地鮑種質(zhì)資源造成遺傳污染等危險(xiǎn)。目前國內(nèi)外關(guān)于黑足鮑分子遺傳學(xué)水平上的研究很少, 且大部分研究集中于種群評估、病理學(xué)和生長發(fā)育方面[3～8]。因此, 運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù),選取合適的遺傳標(biāo)記, 對其野生種的遺傳背景進(jìn)行了解顯得尤為必要。

線粒體基因（mtDNA）的蛋白基因細(xì)胞色素 C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）基因進(jìn)化速度適中, 具有較強(qiáng)的種間解析和鑒別能力, 因而在動(dòng)物的種類鑒定、系統(tǒng)發(fā)生及進(jìn)化遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域中作為分子標(biāo)記而得到廣泛應(yīng)用。

作者對黑足鮑的 COⅠ基因在遺傳分析中的作用作了初步研究。以期為了解其遺傳學(xué)背景提供資料, 也為水產(chǎn)養(yǎng)殖引種、遺傳育種、種質(zhì)資源鑒定以及苗種放流增殖效果的監(jiān)測等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2007年從新西蘭南島中部引進(jìn)的野生黑足鮑,共37個(gè)個(gè)體, 于?20℃冰凍保存。實(shí)驗(yàn)所用組織為黑足鮑腹足肌肉。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

黑足鮑組織消化采用Hye-Suck等[9]的研究方法,并稍加改進(jìn)?；蚪M抽提采用酚、氯仿/異戊醇和改進(jìn)的CTAB法混合（CTAB抽提液: 1mol/L NaCl, 2%CTAB）的抽提方法[10]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

引物序列為: COⅠF: 5′TGATCCGGCTTAGTCGGACTGC3′, COⅠR: 5′GATGTCTT GAAATTACGGTCGGT3′[9,11～12]。反應(yīng)總體積為 25 μL, 其中 10～100 ng模板DNA, PCR Mix（由廣州東盛生物科技有限公司提供）, 0.6 μmol/L引物。94 ℃預(yù)變性 5 min, 94 ℃變性50 s, 46 ℃復(fù)性45s, 72 ℃延伸45s, 30次循環(huán)后72 ℃ 延伸 10 min。

1.2.3 測序

所有樣本均在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司用ABI-377基因分析儀進(jìn)行雙向測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用BioEdit軟件對雙向測序后得到的序列進(jìn)行剪切和拼接、核對; 同時(shí)對照測序的峰形圖對序列進(jìn)行人工核對。利用兩端的引物和 Metz等在 GenBank上提交的黑足鮑COⅠ序列（登錄號(hào): AF060854）對所得序列進(jìn)行最后整理。采用 ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對, 作基因片段的堿基組成、核苷酸變異等初步分析。利用分析軟件DnaSP Version 4.10.9計(jì)算種群的遺傳多樣性, 包括核苷酸多樣性和單倍型多樣性。同時(shí), 運(yùn)用分析軟件MEGA3.1, 以GenBank上提交的貽貝為外群（登錄號(hào): AY377727）, 構(gòu)建 Neighbor-Joining樹和Maximum Parsimony樹。

2 結(jié)果與分析

引物COⅠF和COⅠR具有很高的特異性, 目的基因片段經(jīng) PCR擴(kuò)增后得到清晰的電泳譜帶, 分子質(zhì)量大小在580 bp左右, 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳譜帶見圖1。

圖1 mtDNA COⅠ序列擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 The Amplification results of mtDNA COⅠ sequence

2.1 堿基組成分析

經(jīng)序列測定, 獲得一段長約 550 bp的特異性COⅠ基因片段, 參照GenBank中的黑足鮑COⅠ序列AF060854, 每段序列剪接到524 bp。經(jīng)分析得到37條序列中4種核苷酸A、T、G、C的含量（表1）。個(gè)體之間 4種堿基的含量非常相近, 而且所有個(gè)體A+T的含量相等, 都為53.8%, 高于GC含量。較高的A+T含量符合mtDNA堿基組成的特點(diǎn)。

2.2 核苷酸變異及遺傳多樣性分析

在37個(gè)黑足鮑樣本的序列中共檢測出3個(gè)變異位點(diǎn), 是這段長度的0.57%（3/524）, 其中一個(gè)為顛換,另兩個(gè)為轉(zhuǎn)換, 沒有發(fā)現(xiàn)插入或缺失突變的核苷酸位點(diǎn); 這3個(gè)變異位點(diǎn)定義了3個(gè)單倍型（表2）。其中, 32個(gè)樣本為單倍型 HapA, 2個(gè)樣本為單倍型HapB, 3個(gè)樣本為單倍型HapC。實(shí)驗(yàn)中黑足鮑的單倍型特別少, 不同單倍型之間也只有 1～2個(gè)堿基的差異。同時(shí)這 3個(gè)單倍型在個(gè)體中的分布明顯不均衡, 單倍型HapA出現(xiàn)的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單倍型HapB與HapC。

經(jīng)分析得到核苷酸多樣性指數(shù)為0.000 79、單倍型多樣性指數(shù)為0.249、平均核苷酸差異數(shù)為0.411,可見黑足鮑的遺傳多樣性低。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

以貽貝為外群構(gòu)建的NJ和MP系統(tǒng)發(fā)育樹顯示結(jié)果相似, 此處只列出NJ樹（圖2）。黑足鮑處于相對適中的位置。屬內(nèi), 黑足鮑與弗吉尼亞鮑（H.virginea）親緣關(guān)系最近。種內(nèi), 本實(shí)驗(yàn)獲得的單倍型HapC與GenBank上提交的單倍型AF060854最近。

3 討論

表1 37個(gè)黑足鮑個(gè)體的COⅠ基因片段的堿基組成（%）Tab. 1 Base composition（%） of mtDNA COⅠ fragment sequences in 37 Blackfoot abalones

基因測序與RAPD、RFLP 等其他分子遺傳方法相比, 能提供更加準(zhǔn)確的遺傳信息。不同的基因?qū)ν晃锓N具有不同的解析能力, 同一基因在不同的物種間解析能力也有差異[2]。Mather等[13]發(fā)現(xiàn), 同一地理種群的羅氏沼蝦 （Macrobrachium rosenbergii）,COⅠ基因的平均序列差異可達(dá)到 15%～16%。馮建彬等[14]在對我國五大淡水湖日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）的COⅠ基因序列研究中, 100個(gè)野生個(gè)體的578 bp核苷酸片段中有49個(gè)變異位點(diǎn), 得到了35個(gè)單倍型, 且各種群都具有較高的單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性。

表2 黑足鮑COⅠ基因片段的核苷酸變異位點(diǎn)及單倍型頻率Tab. 2 Variable sites within the sequences of the Blackfoot abalone and the distributions of haplotypes among different individuals

圖2 黑足鮑與同屬其他鮑的COⅠ系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ樹）Fig. 2 Neighbor-Joining Tree of Phylogenetic Relationships of Blackfoot abalone Haplotypes in the experiment and other abalones submitted in GenBank based on COⅠ

在本實(shí)驗(yàn)的 37條新西蘭黑足鮑的 524 bpCOⅠ序列中, 僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)變異位點(diǎn), 得到3個(gè)單倍型, 單倍型之間的堿基差異只有 1～2個(gè)。同時(shí)遺傳多樣性指數(shù)也都較低, 其中單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為 0.249和 0.000 79, 平均核苷酸差異數(shù)為0.411。由以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出, COⅠ基因在37個(gè)野生黑足鮑中表現(xiàn)出了較低的序列差異, 反映了 37個(gè)個(gè)體 COⅠ基因片段進(jìn)化速率具有一致性以及COⅠ基因片段在進(jìn)化過程中具一定的保守性, 不能很好地揭示種內(nèi)的遺傳分化, 可能更適用于種以上階元的遺傳多樣性分析。

致謝:實(shí)驗(yàn)工作得到陶翠花, 劉瑩瑩, 趙琦, 張婷,張文學(xué), 妙星, 許敏的幫助, 論文寫作得到周燦的幫助, 謹(jǐn)此一并致謝。

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Received: Dec., 12, 2009

Key words:Blackfoot abalone （Haliotis iris）; COI; genetic diversity; phylogeny

Abstract:Genetic analysis of 37 Blackfoot abalones from New Zealand was studied based on cytochrome c oxidase subunit I （COⅠ） of mitochondrial DNA （mtDNA）. In 524 base pairs, three variable sites and three haplotypes were detected. The haplotype and nucleotide diversity were 0.249 and 0.000 79, respectively, indicating that the genetic diversity of Blackfoot abalone was very low. Blackfoot abalone lies in the middle position of the phylogenetic tree constructed with Mussel （Mytilus edulis） as outgroup. It was expected that these results can be used for further studies of genetic background and COⅠgene of Blackfoot abalone.

（本文編輯:梁德海）

Genetic analysis of blackfoot abalone （Haliotis iris） based on COⅠgene fragment

GAO Hai-xia1, HOU Xu-guang1, ZHU Qian1,2
（1. Ocean College, Shandong University at Weihai, Weihai 264209, China; 2. Third Institute of Oceanography,State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China）

Q812

A

1000-3096（2010）11-0014-04

2009-12-12;

2010-03-11

國家海洋局項(xiàng)目（HC10301-10, HD10301-10）; 國家海洋局第三海洋研究所項(xiàng)目（HE09701（1）, HE09702（1））

高海霞（1984-）, 女, 山東濱州人, 碩士研究生, 主要從事保護(hù)生物學(xué)研究, E-mail: bluocean200@yahoo.com.cn; 祝 茜, 通信作者,教授, 博士, 主要從事海洋動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)和視覺生物學(xué)研究, 電話:0631-5688004, E-mail: qianzhu@sdu.edu.cn