劉文翔

(陜西師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 ,陜西西安 710062)

二維液相色譜分離中藥復(fù)方銀黃口服液中的有效成分

劉文翔

(陜西師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 ,陜西西安 710062)

建立了二維液相色譜方法分離中藥復(fù)方銀黃口服液的成分。按照中國藥典銀黃口服液項(xiàng)下比例制備[1],以 CN柱作第一維色譜柱,甲醇和 0.1%甲酸水溶液梯度洗脫分離;以 C18柱作第二維色譜柱,乙腈和 0.1%甲酸水溶液梯度洗脫分離。搭建的二維液相色譜的峰容量顯著高于一維色譜,分離效率得到了明顯的提高。該方法操作簡便,可作為中藥等復(fù)雜體系分離分析的有效手段。

二維液相色譜;銀黃口服液;活性成分

多維液相色譜分離技術(shù) (MDLC)是利用兩根或多根性質(zhì)不同的色譜柱對復(fù)雜樣品中的待分析組分進(jìn)行分離[2]。不同的液相色譜模式如排阻色譜(SEC)、親和色譜 (AC)、離子交換色譜 (IEC)、疏水作用色譜 (H I C)、反相色譜 (RPC)等都可以用來組合、構(gòu)建多維液相色譜。根據(jù)對一維洗脫流分進(jìn)行后續(xù)分離的連續(xù)性,多維色譜分離可以分為離線模式和在線模式。Giddings指出,多維色譜的總峰容量 (P)等于每一維的峰容量 (Pi)的乘積,即:P=P1×P2×P3×…[3]。因此從理論上可知,多維色譜分離系統(tǒng)比一維色譜可提供更高的峰容量,更適合于復(fù)雜體系的分離。

銀黃口服液是由唇形科植物黃芩的干燥根與忍冬科植物金銀花的干燥花藥材提取加工而成,具有抗菌、清熱解毒、消炎、退熱等作用,臨床上廣泛應(yīng)用于上呼吸道感染、急慢性扁桃體炎、咽喉炎等癥的治療。其中原料藥材黃芩為常用中藥,具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效[4]。它的藥用歷史悠久,有效成分眾多,其中含量較高的活性成分有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等[5]。原料藥材金銀花也為常用的中藥,同樣具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效。它的主要有效成分為綠原酸及異綠原酸,也含有有機(jī)酸類、三萜類、黃酮類、揮發(fā)油類等成分[6]。其復(fù)方口服液的有效成分則更為復(fù)雜。

目前對復(fù)方銀黃口服液的研究報(bào)道較少,本文采用二維液相色譜對復(fù)方銀黃口服液進(jìn)行了研究,從而對復(fù)方銀黃口服液能夠進(jìn)行更好的質(zhì)量控制。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

儀器:LC-20AB島津高效液相色譜儀,包括LC-20AB泵、SPD-20A檢測器、N-2000色譜工作站;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-52A(上海亞榮生化儀器廠);微波提取裝置由 KD21B-AN2微波爐 (美的集團(tuán)有限公司)改裝而成,附帶冷凝裝置;高速萬能粉碎機(jī) (FW400A北京科偉永興儀器有限公司)。

試劑:金銀花 (產(chǎn)地:陜西);甲醇 (色譜純,美國Fisher公司);乙腈 (色譜純,TED IA公司);水 (娃哈哈純凈水);甲酸 (分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司);金銀花 (產(chǎn)地:陜西)、黃芩 (產(chǎn)地:陜西 )購自當(dāng)?shù)厮幍辍?/p>

1.2樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取金銀花粉末和黃芩粉末各 0.3000g,分別置于兩個(gè) 100mL圓底燒瓶中,各加入 70%甲醇溶液 30mL,微波提取 5min,提取功率為 400W。分別過濾,取濾液,兩種提取液旋轉(zhuǎn)濃縮后,用 70%甲醇溶液定容至 10mL容量瓶中,經(jīng) 0.22μm濾膜過濾,即得金銀花、黃芩提取液。然后,按照中國藥典銀黃口服液項(xiàng)下比例制備 ,金銀花提取液和黃芩提取液按照質(zhì)量比 1∶2混合,得到混合提取液,以此作為供試品溶液。

1.3一維 HPLC條件

采用 CN柱:LC-20AB島津高效液相色譜儀;色譜柱為HypersilCN基柱 (250mm×4.6mm i.d.,5μm,大連依利特分析儀器有限公司);流動(dòng)相:A液為甲醇,B液為 0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫:0～10min,10%～20%A;10～20min,20%～40%A;20～30min,40%～45%A;30～40min,45%～50%A。流速為1.0mL/min;檢測波長為254nm;進(jìn)樣量:20μL。

采用 C18柱:LC-20AB島津高效液相色譜儀;色譜柱為 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱 (4.6mm ×250mm,5μm,Unimicro Technologies.Inc.,USA);流動(dòng)相:A液為乙腈,B液為 0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫:0～20min,10%～35%A;20～40min,35%～60%A。檢測波長:254nm;流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量 20μL。

1.4二維 HPLC條件

第一維:液相色譜條件同 1.3節(jié)一維 HPLC條件下 CN柱色譜條件。第二維:液相色譜條件同 1.3節(jié)一維 HPLC條件下 C18柱色譜條件。

二維 HPLC操作步驟:供試品溶液按照本節(jié)中的第一維色譜條件進(jìn)行分離,從進(jìn)樣開始每 5min收集一次餾分。重復(fù)進(jìn)樣 6次并收集餾分。將相同時(shí)間段收集的餾分合并并旋轉(zhuǎn)濃縮,自然風(fēng)干,用70%甲醇水溶液定量至 0.2mL。然后,進(jìn)樣至第二維 HPLC進(jìn)行分析。

2結(jié)果與討論

2.1一維色譜分離

圖 1和圖 2分別為復(fù)方銀黃口服液在 CN柱和C18柱上的分離效果。從圖 1和圖 2中可以看出,復(fù)方銀黃口服液在這兩個(gè)柱子上,在選定的條件下,組分得到了一定的分離。由于兩根柱子不同的分離機(jī)理,所得的兩張色譜圖峰的強(qiáng)度、形狀和保留時(shí)間都各不相同。從這兩個(gè)色譜柱的分離效果來看,樣品色譜峰在第一維 CN柱的平均峰寬為 1min,理論峰容量為 40,實(shí)際分離出 16個(gè)峰;樣品色譜峰在第二維 C18柱的平均峰寬為 0.5min,理論峰容量為80,實(shí)際分離出 20個(gè)峰。

圖 1銀黃口服液在 CN柱上的分離色譜圖

圖 2銀黃口服液在 C18柱上的分離色譜圖

2.2二維色譜體系的構(gòu)建

構(gòu)建一個(gè)二維色譜體系,從理論上來說,第一維和第二維體系應(yīng)該滿足正交性,即這兩維體系的分離機(jī)理應(yīng)盡量不同,且第二維的分離不能降低前一維的分辨率[7]。CN柱的極性較強(qiáng),對極性物質(zhì)有很好的保留和分離能力;而 C18柱極性較弱,對非極性物質(zhì)有很好的保留和分離能力;且溶劑甲醇和乙腈對物質(zhì)的選擇性有所不同;所以如果用這兩個(gè)色譜柱構(gòu)建一個(gè)二維分離體系,有一定的正交性,適合中藥復(fù)雜體系的分離[8]。由上面一維分離的結(jié)果看,其中 C18柱顯示了更強(qiáng)大的分離能力,分離效果比 CN柱好。所以,在構(gòu)建二維分離體系時(shí),將以 CN柱作為第一維,C18柱作為第二維。

2.3二維色譜分離

以 CN柱為第一維,C18柱為第二維,構(gòu)建了一個(gè)二維色譜分離體系,二維峰容量為每一維峰容量的乘積,所以搭建的這個(gè)二維分離體系的理論峰容量應(yīng)為 3200。圖 3和圖 4分別為收集的每一個(gè)餾分在第二維 C18柱上的色譜分離圖。從圖 4可以看到,至少有 53種成分得到了較好的分離,比一維色譜顯著地提高了分離效率。

圖 3餾分 1,2,3,4在 C18柱上的分離色譜圖

圖 4餾分 5,6,7,8在 C18柱上的分離色譜圖

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對自制的銀黃口服液進(jìn)行了一維分離和二維分離。結(jié)果表明,在一維分離中 CN柱上得到了 16種組分,C18柱上得到了 20種組分。在二維分離中共得到 53種組分,比一維分離中得到了更多的組分。顯然,二維液相色譜的峰容量顯著高于一維色譜,有利于組分的鑒定;但是,從二維圖上看到,二維的分離仍然有些不完全,有些組分還分不開,仍需進(jìn)行多維分離。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:580.

[2] GrayM J,Dennis G R,Slonecker P J,et al.J Chromatogr A,2004,1041:101-110.

[3] Giddings J C.Two-dimensional separations concept and promise[J].AnalyticalChemistry,1984,56(12):1258-1270.

[4] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:248.

[5] 中藥有效成分提取分離技術(shù).北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2008:103-104.

[6] 劉 雄,高建德.金銀花質(zhì)量控制、化學(xué)成分及藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,23(4):46-49.

[7] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:580.

[8] 王智聰,張慶合,張維冰,等.分析化學(xué),2005,33(4):437-441.

[9] Chen X G,KongL,Su X Y,et al.J ChromatogrA,2004,1040:169-178.

TQ028.4

B

1003-3467(2010)24-0041-03

2010-12-01

劉文翔 (1984-),女,碩士,電話:15029924348。