段效輝,耿金培,方紹慶,李俊峰

(1.煙臺出入境檢驗檢疫局,山東煙臺 264000;2.青島科技大學,山東青島 266003)

普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株Y68葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的純化及特性研究

段效輝1,耿金培1,方紹慶1,李俊峰2

(1.煙臺出入境檢驗檢疫局,山東煙臺 264000;2.青島科技大學,山東青島 266003)

運用離子交換層析法和凝膠過濾層析法分離純化普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株Y68胞內(nèi)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡稱GTF),并以SDS-PAGE、Native-PAGE對蛋白質(zhì)進行量化、比較及特性鑒定,研究其酶學特性。結(jié)果表明短梗霉Y68中GTF被分離純化,純化酶在SDS-PAGE凝膠電泳上顯示分子量50.8 ku單一條帶,而在Native-PAGE凝膠電泳上顯示分子量350 ku單一條帶。純化酶的最適酶反應pH和最適酶反應溫度分別為6.0和40℃,酶對pH十分敏感,穩(wěn)定性較差,對溫度的穩(wěn)定性則稍好。GTF為金屬酶,Na+和K+對酶有激活作用,Ca2+、Mn2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Hg2+、Co2+對酶活性有抑制作用,Hg2+對酶活性的抑制作用說明酶活性中心含有二锍鍵。EDTA、PMSF、SDS和碘乙酸對GTF活性有很大的抑制作用,而二硫蘇糖醇(DTT)對酶活性有保護作用。

短梗霉;葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶;胞內(nèi)酶;純化

普魯蘭多糖是一種由出芽短梗霉發(fā)酵所產(chǎn)生的類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性粘質(zhì)多糖。該多糖有兩個重要的特性:結(jié)構(gòu)上富有彈性,溶解度比較大。普魯蘭多糖的成膜性、阻氣性、可塑性、粘性均較強,并且具有易溶于水、無毒無害、無色無味等優(yōu)良特性,像很多的微生物胞外多糖一樣已廣泛應用于醫(yī)藥、食品、輕工、化工和石油等領(lǐng)域[1-2]。2006年5月19日,國家衛(wèi)生部發(fā)布了第8號公告,普魯蘭多糖為新增4種食品添加劑之一,可在糖果、巧克力包衣、膜片、復合調(diào)味劑和果蔬汁飲料中用作被膜劑和增稠劑。普魯蘭多糖在食品領(lǐng)域越來越廣泛的應用也使得對該多糖的工業(yè)化生產(chǎn)變得迫在眉睫。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)是糖基轉(zhuǎn)移酶的一種,它具有催化高能底物合成聚糖的功能,來自于微生物的GTF能夠從許多形式的D-葡萄糖基供體物質(zhì)中把非還原的D-葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到合適的受體物質(zhì),它也能夠幫助轉(zhuǎn)移葡萄糖基到C6羥基從而合成寡糖和糖苷,并進而組裝成為線性或分枝的糖鏈[3]。目前研究較多的有引起齲齒的變形鏈球菌中的GTF及微生物合成海藻糖必需的GTF等。微生物出芽短梗霉可合成胞外普魯蘭多糖,作為一種具有轉(zhuǎn)葡糖苷作用的轉(zhuǎn)移酶,GTF在普魯蘭多糖的合成中扮演著怎樣的角色,目前還未見報道。本實驗室保存的短梗霉菌株Y68,不產(chǎn)黑色素,轉(zhuǎn)化率高,胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量最高可達14.7 g/g細胞干重[4-5],明顯高于目前報道的其他短梗霉菌株的產(chǎn)量,具備了研究高產(chǎn)菌株普魯蘭多糖產(chǎn)量與GTF間關(guān)系的基礎。本研究對普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株Y68細胞內(nèi)GTF活力與胞外多糖產(chǎn)量間的關(guān)系進行研究,并分離純化其細胞內(nèi)GTF,研究其酶學特性,為實現(xiàn)普魯蘭多糖工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株短梗霉Y68 (本實驗室于-80℃保藏)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①YPD培養(yǎng)基:可溶性淀粉20.0 g,蛋白陳20.0 g,酵母粉10.0 g,葡萄糖20.0 g,蒸餾水1000 mL,115℃,滅菌30 min;②豆餅粉水解液培養(yǎng)基(質(zhì)量體積比,%):葡萄糖2.0,豆餅粉水解液2.0,K2HPO40.5,NaCl 0.1,MgSO4·7H2O 0.02,(NH4)2SO40.06,初始pH 6.5,121℃,滅菌20 min。

1.1.3 儀器 超濾系統(tǒng):LabscaleTMTFF System, Millipore,美國;蛋白質(zhì)純化系統(tǒng):?KTATMpri me with HitrapTM,Amersham,瑞典;雙向電泳系統(tǒng): Amersham,瑞典。

1.2 方法

1.2.1 Y68細胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量與細胞內(nèi)GTF活力的關(guān)系研究 分別選擇葡萄糖、蔗糖、糊精、果糖、麥芽糖和木糖作為培養(yǎng)基唯一碳源,28℃培養(yǎng)60 h后,測定不同碳源情況下胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量和胞內(nèi)GTF活力。①胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量的測定:Y68菌株28℃發(fā)酵培養(yǎng)60 h,發(fā)酵液沸水浴15min,降溫后離心(12000 r/min,4℃, 6 min)。取上清液3 mL,加入2倍體積的冰凍無水乙醇,混合均勻,將混合物于4℃下放置數(shù)小時,離心(12000 r/min,4℃,6 min)。棄上清液,將獲得的多糖在80℃烘干至恒重,電子天平稱重;②GTF活性測定:在10 mm×150 mm試管加入0.2 mL,10 mmol 4-硝基-α-D-吡啶葡萄糖苷(PNPG),在40℃水浴中進行溫度平衡5 min(4-硝基-α-D-吡啶葡萄糖苷用0.1 mol/L,pH 4.0乙酸鈉緩沖液進行配制);在溫度平衡的底物試管中加入0.2 mL經(jīng)過適當稀釋的待測酶液,快速混勻后開始計時,反應時間共5 min;反應達到預定時間時,加入3 mL 0.4 mol/L、pH 10.5的甘氨酸-NaOH緩沖液中止反應;測定OD405nm,由標準曲線進行計算。酶活單位定義為每分鐘釋放1μmol 4-硝基酚所需要的酶量[6]。

1.2.2 GTF蛋白的純化 結(jié)合Sephadex G-200凝膠過濾和DEAE-Sephorose Fast Flow陰離子交換2種色譜方法,純化Y68細胞內(nèi)GTF,收集具有GTF酶活力的洗脫液進行酶學特性分析,并利用蛋白電泳進行量化分析。①總蛋白的測定:蛋白含量測定采用Bradford的方法,以牛血清白蛋白為標準[7];②粗酶液的制備:活化菌種接種于裝有50 mL豆餅粉水解液培養(yǎng)基的三角瓶中28℃、180 r/min培養(yǎng)8～10 h,4℃、2500 r/min離心5 min收集菌體,冷凍蒸餾水洗滌3次,每50 mL培養(yǎng)液得到的菌體用磷酸鹽緩沖液重新懸浮后加入0.1 mL、10 mg/mL消解酶(zymolyase,Sigma),37℃,酶作用90 min。4℃、14000 r/min離心20 min,去除細胞碎片,上清即為粗酶液。多次處理得到的粗酶液,在超濾系統(tǒng)濃縮至6～9 mL。整個超濾過程在4℃下進行;③Sephadex G-200凝膠過濾:將超濾后得到的濃縮液上樣至上述平衡后且均勻的凝膠柱。在柱壓0.1 MPa、流速0.5 mL/min條件下洗脫,自動分部收集,每管收集3 mL,測定每個收集管GTF活力和總蛋白含量。整個洗脫過程在Amersham蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)中4℃下進行,波長280 nm下檢測樣品光吸收,自動分部收集,每管收集3 mL;④DEAE-Sephorose Fast Flow陰離子交換:將凝膠過濾分部收集的具有GTF活力的收集管合并,使用50 ku離心超濾膜(Millipore,美國),4℃、14000 r/min離心濃縮至4～6 mL,除0.5 mL用于凝膠電泳檢測外,全部上樣至16 cm×25 cm DEAE-Sephorose Fast Flow陰離子交換層析柱,在柱壓0.3MPa、流速1 mL/min下用1 mol/L NaCl和離子交換緩沖液梯度洗脫,利用Amersham蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)自動分部收集,每管收集3 mL;⑤超濾濃縮收集液:經(jīng)離子交換層析收集的樣品使用50 ku離心超濾膜(Millipore,美國),4℃、14000 r/min離心濃縮至4～6 mL;⑥不連續(xù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE):參照Laemmli的方法進行SDS-PAGE凝膠電泳[8];⑦連續(xù)常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳(N-ative-PAGE):參照Laemmli的方法進行SDSPAGE凝膠電泳[8];⑧GTF活力的測定:同

1.2.1 ②。

1.2.3 Y68細胞內(nèi)GTF酶學特性研究 ①酶的最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性:酶反應混合物分別于28、30、37、40、42、45、50、55、60和65℃水浴中反應5 min,分別測定GTF活力,確定酶的最適反應溫度。將純化的酶液置于28、30、37、40、42、45、50、55、60和65℃水浴中保溫10 min,按常規(guī)酶活測定方法測剩余酶活力,確定酶的溫度穩(wěn)定性;②酶的最適反應pH和pH穩(wěn)定性:分別以pH為3.0、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、7.0、8.0的緩沖液取代原測定方法中的緩沖液,測定不同pH下GTF的活力,確定酶的最適反應pH。使用的緩沖液包括0.01 mol/L乙酸緩沖液(pH 4.0～5.0), 0.01 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.0～7.0)和0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5～9.0)。純化的酶液分別與pH為3.0、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、7.0、8.0的緩沖液等體積混合,4℃保溫30 min,按常規(guī)酶活測定方法測剩余酶活力,確定酶的pH穩(wěn)定性;③金屬離子對酶活性的影響:在酶活測定反應混合物中加入Ba2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、K+、Na+、Hg+,一價離子使用濃度為12.5 mmol/L,二價離子使用濃度為25 mmol/L,測定GTF活力;④各種蛋白抑制劑對酶活性的影響:將各種蛋白抑制劑(二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、碘乙酸、十二烷基硫酸鈉(SDS))加入純化的酶液中,4℃保溫10 min,按常規(guī)酶活測定方法測剩余酶活力;⑤Km和Vm ax值的測定:為測定純化酶液對PNPG的Km和Vm ax,測定PNPG的濃度分別為0.5、2.5、5.0、7.5和10 mmol/L時的GTF活力;以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標,反應速度倒數(shù)為縱坐標做圖。

2 結(jié) 果

2.1 不同碳源情況下胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量與胞內(nèi)GTF活力的關(guān)系

以不同的碳源配制的培養(yǎng)基28℃、180 r/ min培養(yǎng)Y68菌株60 h,測定其胞內(nèi)GTF的活力和胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量,研究碳源對GTF活力的影響,了解GTF與胞外多糖產(chǎn)量之間的關(guān)系,結(jié)果見圖1。

圖1 不同碳源培養(yǎng)基對胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量和胞內(nèi)GTF的影響Fig.1 The changes in pullulan yield and enzyme activity in the fermentation medium with different carbon sources

由圖1看到,當葡萄糖作為培養(yǎng)基中唯一碳源時,GTF的活力相對于其他碳源培養(yǎng)基是最高的,而木糖作為唯一碳源時活力是最低的,其變化規(guī)律與胞外多糖產(chǎn)量的變化基本相同。這一結(jié)果表明該酶與胞外多糖產(chǎn)量之間關(guān)系密切,很可能碳源通過對GTF的影響進而影響到胞外多糖產(chǎn)量的變化。從另一方面也可以說明胞內(nèi)GTF有效促進了胞外普魯蘭多糖的產(chǎn)生。

2.2 GTF的分離與純化

2.2.1 GTF的分離純化 將3.0 mL經(jīng)超濾濃縮的粗酶液上樣至經(jīng)凝膠過濾緩沖液平衡的Sephadex G-200凝膠過濾層析柱上,用凝膠過濾緩沖液洗脫。經(jīng)酶活測定得知,粗酶液在Sephadex G-200凝膠過濾中出現(xiàn)第1個洗脫峰具有GTF活性。將Sephadex G-200凝膠過濾自動收集的、具有GTF活力的收集管合并,全部上樣至經(jīng)陰離子交換緩沖液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱,待樣品被凝膠吸收后,陰離子交換緩沖液洗滌層析柱1 h,用1 mol/L NaCl和離子交換緩沖液進行梯度洗脫,經(jīng)酶活測定發(fā)現(xiàn),在NaCl濃度達到0.59 mol/L時,出現(xiàn)的第1個峰具有GTF活力。將具有活性的純化酶液用50 ku的離心超濾膜(Millipore,美國)濃縮至4～6 mL,電泳檢測純度并進行分子量測定,結(jié)果見表1。

表1 GTF的分離純化結(jié)果Table 1 Summary of purification procedures of glucosyltransferase

普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株Y68經(jīng)細胞破碎釋放胞內(nèi)蛋白、超濾濃縮、Sephadex G-200凝膠過濾和DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析等純化過程,經(jīng)SDS-PAGE和Native-PAGE電泳證實, GTF被純化,純化倍數(shù)2.49倍,收率13.9%。

2.2.2 不連續(xù)SDS-PAGE和連續(xù)Native-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳 經(jīng)濃縮的純化酶液20μL與等量的SDS-PAGE電泳樣品緩沖液混合,沸水加熱5 min,上樣至5%濃縮膠、12%分離膠制成的非連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠上、120 V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍前沿進入分離膠,改用200 V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍前沿離凝膠下沿1～2 cm。結(jié)束電泳小心取出凝膠,按上述方法用考馬斯亮藍進行染色,結(jié)果見圖2。圖2顯示目標蛋白為單一條帶,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)(G:Box Syngene,英國)分析,純化蛋白的表觀分子量為50.8 ku。

圖2 純化蛋白在SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified glucosyltransferase 1:粗酶液;2:凝膠過濾層析;3:離子交換層析;4:蛋白Marker

取經(jīng)濃縮的純化酶液20μL與等量的Native-PAGE電泳樣品緩沖液混合,上樣至5%濃縮膠、10%的連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠上,120 V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍前沿進入分離膠,改用200 V穩(wěn)壓電泳至溴酚蘭前沿離凝膠下沿1～2 cm。結(jié)束電泳小心取出凝膠,按上述方法用考馬斯亮藍進行染色,結(jié)果見圖3。由圖3可看出,純化蛋白仍為單一條帶,但是經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析,純化蛋白的表觀分子量變?yōu)?50 ku。

圖3 純化蛋白在Native-PAGE電泳圖Fig.3 Native-PAGE analysis of the purified glucosyltransferase 1:凝膠過濾層析;2:離子交換層析;3:蛋白Marker

實驗結(jié)果表明,短梗霉Y68的GTF在SDS-PAGE和Native-PAGE上都呈現(xiàn)單一條帶,Native-PAGE上的分子量大于McCleary和Gibson[9]報道的黑曲霉中的GTF分子量(116 ku)。在兩凝膠中呈現(xiàn)的分子量差別較大,其原因可能是該GTF由幾個分子量相似的亞基組成,從而與黑曲霉中的GTF作用方式也會有很大不同,很可能是幾個復合亞基的共同作用。

2.3 GTF的酶學特性

2.3.1 酶的最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性 反應混合物分別于28、30、37、40、50、55、60和65℃水浴中反應5 min,分別測定GTF活力,結(jié)果見圖4。由圖4可以看出,純化酶液在反應溫度低于40℃的范圍內(nèi),酶活隨溫度的升高而升高,在反應溫度為40℃時達到最高,當反應溫度大于40℃時,隨著溫度的升高酶活迅速下降。值得注意的是,作為胞內(nèi)酶,該酶在低于40℃的條件下相對穩(wěn)定,能保持較高活力。

圖4 溫度對GTF活力(A)及熱穩(wěn)定性(B)的影響Fig.4 Effect of temperature on activity(A)and thermal stability(B)of glucosyltransferase from Y68

溫度對酶的活力影響主要體現(xiàn)在2個方面:一方面溫度升高,與一般化學反應一樣,反應速度加快;另一方面隨著溫度的升高,酶蛋白逐漸變性,反應速率隨之下降。酶的最適反應溫度是這2個方面平衡的結(jié)果。最適反應溫度往往受到反應時間、底物濃度、酶濃度、pH值、激活劑或抑制劑等因素的影響。在本實驗條件下,純化的GTF反應的最適溫度為40℃。該酶熱穩(wěn)定性差于McCleary和Gibson[9]報道的黑曲霉中的GTF,其最適溫度也遠低于黑曲霉中的GTF(70℃)。

2.3.2 GTF的最適作用pH 分別以pH為4.0、5.0、6.0、6.6、7.0、7.6、8.0、9.0的緩沖液,取代酶活測定中反應混合物中的緩沖液,測定不同pH下GTF的活力,結(jié)果見圖5A。純化的酶液分別與pH為3.0、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、7.0、8.0的緩沖液等體積混合,4℃保持30 min,測定剩余酶活力,結(jié)果見圖5B。

圖5 pH對GTF活力(A)及穩(wěn)定性(B)的影響Fig.5 Effects of pH on activity(A)and stability(B)of glucosyltranslase

從圖5A可看出,GTF酶在pH 3.0～6.0之間隨著pH的上升酶活提高,在pH 6.0時酶活最高,當pH大于6.0時,酶活迅速下降,說明該酶對pH的變化也非常敏感。pH變化對酶活的影響主要是由于酸堿改變酶的空間結(jié)構(gòu)使酶失活,或酸堿影響酶的活性部位使可解離基團解離、酶分子活性中心催化基團和結(jié)合基團的解離、底物的解離以及酶-底物復合物的解離,從而影響反應動力學性質(zhì),影響酶反應速度。最適反應pH也不是酶的特征性物理常數(shù),它往往受到反應時間、底物、酶濃度、反應溫度、激活劑或抑制劑等因素的影響,因此酶的最適反應pH只是一定反應條件下的結(jié)果。圖5B表明,在本實驗條件下,純化的GTF反應的最適pH為6.0,在低于pH 4.6或高于pH 6.0的環(huán)境中保持30 min,酶活均迅速下降,說明類酵母GTF的pH穩(wěn)定性相對較差。這一特性與McCleary和Gibson[16]報道的該酶的最適pH(4.0～4.5)不同而pH穩(wěn)定性則幾乎相同。

2.3.3 金屬離子對GTF活性的影響 將酶活性測定反應混合物中加入Cu2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Ba2+、K+、Na+、Hg+,一價離子的濃度為12.5 mmol/L,二價離子的濃度為25 mmol/L,測定GTF活力,結(jié)果見圖6。

圖6 金屬離子對GTF活力的影響Fig.6 Effects of different ions on activity of glucosyltransferase in Aureobasidium pullulans Y68

實驗中測定了10種金屬離子對純化的GTF活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)K+和Na+對酶活性有激活作用,酶活力分別提高了15.4%和29.1%。而Hg2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+和Fe2+對酶活有抑制作用,酶活力分別被抑制82.8%、19.8%、11.1%、64.7%、15.3%、14%、8.9%和17.9%。酶活性被Hg2+離子抑制表明酶活性中心二硫鍵被破壞。

2.3.4 不同蛋白質(zhì)抑制劑對酶活力的影響 將各種蛋白質(zhì)抑制劑加入純化的酶液中,4℃保持10 min,測定剩余酶活,結(jié)果見表2。表2顯示, EDTA、PMSF、碘乙酸和SDS對酶活均有很大的抑制作用,而DTT對酶活性有保護作用。EDTA抑制酶活性說明GTF是金屬酶。PMSF和碘乙酸對酶活有抑制作用,說明該酶的活性中心存在絲氨酸(Ser)殘基和半胱氨酸(Cys)殘基。

2.3.5 酶的動力學常數(shù) 以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測定米氏常數(shù)Km。GTF對PNPG的Km如圖7所示,Km和Vm ax分別為1.03 mmol/ mL和1.107μg/min。

表2 不同蛋白質(zhì)抑制劑對GTF活力的影響Table 2 Effects of different compounds on glucosyltransferase activity

3 討 論

本研究表明,短梗霉菌株Y68合成的胞外多糖產(chǎn)量與胞內(nèi)GTF活力成正比例關(guān)系。與口腔內(nèi)變形鏈球菌合成胞外多糖形成齲齒相似[10], GTF活力高的情況下,其胞外多糖產(chǎn)量也高;同樣GTF活力低的情況下,胞外多糖產(chǎn)量也低。葡萄糖是產(chǎn)生高活力GTF和高產(chǎn)量胞外多糖的最佳碳源。適宜的碳源促進了GTF活力,高的GTF活力是較高胞外普魯蘭多糖產(chǎn)量的必要前提。本研究還純化了高產(chǎn)普魯蘭多糖菌株Y68胞內(nèi)GTF,結(jié)果表明:在酶學特性上,與已有相關(guān)報道相比,本研究中短梗霉Y68胞內(nèi)GTF與之前報道的黑曲霉中的相應酶從分子量和酶學特征方面都有很大差異。如其分子量為350 ku,明顯高于黑曲霉中116 ku的分子量。另外,Y68細胞中該酶只在40℃以下、pH 4.6～6.0條件下保持較好穩(wěn)定性,明顯差于黑曲霉GTF在65℃、pH 4.0～7.0還保持較高活力的穩(wěn)定性。同樣,金屬離子對2種生物內(nèi)的GTF活力也有不同的影響,Mn2+對Y68細胞中GTF活力有微弱抑制作用而對黑曲霉中GTF活力則有顯著的促進作用。多方面物理生化特征的差異導致了不同生物細胞內(nèi)GTF作用方式的不同。可以推測,正是這種作用方式的不同才使得不同微生物合成了多種結(jié)構(gòu)不同的胞外多糖。本實驗室還會繼續(xù)對短梗酶菌株Y68細胞內(nèi)其他與胞外多糖合成相關(guān)的酶,如磷酸葡萄糖變位酶、尿嘧啶二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶等進行研究。一方面通過分離純化得到各相關(guān)酶,并模擬胞外多糖合成條件,進行體外胞外多糖合成的試驗,了解胞外普魯蘭多糖合成的機理;另一方面希望通過對各相關(guān)酶基因的克隆與表達,從基因水平上調(diào)節(jié)其胞外多糖的合成,從而可以從分子水平探究其胞外多糖合成機理并建立起GTF高表達株,最終實現(xiàn)胞外多糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

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DUAN Xiao-hui1,GENG Jin-pei1,FANG Shao-qing1,L IJun-feng2
(1.Yantai Entry-Exit Inspect.&Quar.Bureau.,Yantai264000;2.Qingdao Uni.of Sci.&Technol.,Qingdao266003)

Intracellular glucosyltransferase(GTF)from pullulan high-yielding strain Y68 was isolated and purified by ion exchange chromatography and gel filtration chromatography,the protein was qualified,compared and characterized to study its enzymological features by SDS-PAGE and Native-PAGE.The results showed that GTF from Aureobasidium pullulans was isolated and purified and its molecular mass 350 ku with single band on the Native-PAGE gel,but 50.8 ku with single band on the SDS-PAGE gel which indicated the enzyme was composed of several subunits.The most suitable reaction pH and temperature of purified GTF was 6.0 and 40℃respectively,and the enzyme was very sensitive to temperature and had poor stability.GTF was an metallic enzyme,Na+and K+could activate it.However, Ca2+,Mn2+,Mg2+,Ba2+,Cu2+,Fe2+,Hg2+,and Co2+inhibited its activity.The inhibition of Hg2+against it indicated that the activity core of the enzyme contained bi-sulphonium bond.EDTA,PMSF,SDS,and iodo-acetidin greatly inhibited GTF’s activity;but dithiothreitol(DTT)had protective role of its activity.

Aureobasidium pullulans;glucosyltransferase;purification

Q55

A

1005-7021(2010)06-0032-07

國家質(zhì)檢總局科研項目(20051K022)

段效輝 女,工程師,博士。主要從事食品微生物檢測和研究工作。

Tel:0535-6665905,E-mail:xiaohuiduan66@yahoo.com.cn

2010-07-28;

2010-10-29