許麗娜,程 凱＊,許 敏,趙以軍,楊季芳,陳吉剛,吳慶喜

（1.華中師范大學(xué)城市水環(huán)境生態(tài)學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430079;2.浙江萬里學(xué)院寧波市微生物與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波替換為 315100）

一株新型寄生溶藻細(xì)菌的分離及初步鑒定

許麗娜1,程 凱1＊,許 敏1,趙以軍1,楊季芳2,陳吉剛2,吳慶喜2

（1.華中師范大學(xué)城市水環(huán)境生態(tài)學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430079;2.浙江萬里學(xué)院寧波市微生物與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波替換為 315100）

從寧波象山港分離得到1株具有溶藻能力的細(xì)菌,命名為 XD-G.該菌株對中肋骨條藻（Skeletonema costatum1115）的溶藻效果較好,感染1 d后,藻細(xì)胞基本裂解,葉綠素a減少達(dá)66.5%.在透射電子顯微鏡下觀察菌株XD-G感染9 h后的中肋骨條藻切片,發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞內(nèi)有大量細(xì)菌出現(xiàn),由此推測,菌株XD-G是1種寄生性溶藻細(xì)菌.菌株XD-G不但能裂解中肋骨條藻及熱帶骨條藻（Skeletonema troicum）,而且對赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）也有一定的溶藻效果.

赤潮;溶藻細(xì)菌;中肋骨條藻;寄生

隨著我國工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展,沿海城市人口的急劇增長,海洋環(huán)境不斷遭到破壞,水體富營養(yǎng)化日益加劇,赤潮發(fā)生的次數(shù)急劇增加,發(fā)生的面積和規(guī)模也不斷擴(kuò)大.2001年至2009年,我國發(fā)生赤潮共764次,而且自2004年起有毒赤潮頻繁發(fā)生[1-9].赤潮的頻繁發(fā)生極大地危害了海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和漁業(yè)資源,嚴(yán)重地破壞了正常的海洋生態(tài)系統(tǒng),直接威脅著人類的生存環(huán)境和健康水平.因此,赤潮的監(jiān)測與防治已經(jīng)迫在眉睫.

我國沿海引發(fā)赤潮的生物主要是浮游植物,例如甲藻類、硅藻類、藍(lán)藻類、金藻類等[10].目前應(yīng)用的藻類控制技術(shù)主要是超聲波除藻,機(jī)械收藻,粘土沉降藻等物理法[11],以及使用硫酸銅、次氯酸、過氧化氫等滅藻劑的化學(xué)法[12].但物理法控藻費(fèi)用高,而且難以大面積使用,而化學(xué)法控藻容易產(chǎn)生二次污染,造成環(huán)境污染或生態(tài)平衡的破壞,甚至給人類帶來更多危害.因此,人們把更多的目光投向了生物法控藻,其中溶藻細(xì)菌已受到許多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注.

研究表明,在自然水生態(tài)環(huán)境中存在著一些細(xì)菌群體,赤潮的突然消亡可能與這些細(xì)菌有密切聯(lián)系,因此,溶藻細(xì)菌可能成為治理赤潮的有力工具[13].Baker K H等[14]曾發(fā)現(xiàn)1株假單胞菌Pseudomonas sp.T827/2B能分泌一種熱穩(wěn)定性的高分子物質(zhì),對海鏈藻（Thallasiosira pseudonana）有致死作用.鄭天凌等[15]從赤潮多發(fā)區(qū)廈門西海域分離到1株巨大芽孢桿菌Bacillus mgateriumS7和1株芽孢桿菌S10,研究發(fā)現(xiàn)它們能分泌胞外物質(zhì)抑制塔瑪亞歷山大藻（A lexandrium tamarense）的生長.目前,國內(nèi)外報(bào)道較多是分泌胞外物質(zhì)溶解海洋微藻的細(xì)菌,有關(guān)直接接觸或進(jìn)入海洋微藻細(xì)胞內(nèi)致使藻細(xì)胞死亡的細(xì)菌報(bào)道較少。本研究從我國寧波象山港分離得到1株新型的寄生于中肋骨條藻（Skeletonema costatum）細(xì)胞內(nèi)的溶藻細(xì)菌,并對其進(jìn)行了初步的研究.

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)

選用利馬原甲藻（Prorocentrum lima）、東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）、海洋原甲藻（Prorocentrum micans）、微小原甲藻（Prorocentrum minimum）、錐狀斯克里普藻（Scrippsiella trochoidea）、赤潮異彎藻（Heterosigma akashi-wo）、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）、中肋骨條藻、熱帶骨條藻（Skeletonem troicum）、旋鏈角毛藻（Chaetoceros curvisetus）、尖刺偽菱形藻（Psuedonitzshia pungens）.中肋骨條藻來源于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫,其余藻種來源于暨南大學(xué)赤潮與水環(huán)境研究中心.上述藻種均使用f/2液體培養(yǎng)基[16],置于恒溫光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),間隙振蕩,溫度 20±0.5℃,光照強(qiáng)度為2 000 lux,光暗周期比14 h∶10 h.

1.2 溶藻微生物的分離

2009年3 月,采集寧波象山港西店養(yǎng)殖區(qū)深度1～1.5m的表層海水10 L,冰浴,立即帶回實(shí)驗(yàn)室.海水水樣經(jīng) Sartocon Slice Cassette切向流膜包超濾系統(tǒng)反沖超濾濃縮100倍,即得約100 mL水樣濃縮液.水樣濃縮液以體積比1∶2接入上述供試藻種培養(yǎng)液,空白對照組添加過濾海水,將上述接有水樣濃縮液的藻培養(yǎng)液置于20±0.5℃的恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)數(shù)天.觀察藻種培養(yǎng)液顏色的變化,并使用光學(xué)顯微鏡觀察藻細(xì)胞裂解情況.如對某種藻出現(xiàn)溶藻現(xiàn)象,再反復(fù)感染進(jìn)行穩(wěn)定性感染測試,對能夠連續(xù)穩(wěn)定感染5次以上者進(jìn)行下述研究.

1.3 溶藻微生物的溶藻效果

按上述方法分離得到溶中肋骨條藻的微生物.將中肋骨條藻裂解液按1%的體積比接種至對數(shù)期的中肋骨條藻培養(yǎng)液中,空白對照組加入過濾海水,使用丙酮法測定感染前及感染1 d后的葉綠素a含量[17],同時(shí)在光學(xué)顯微鏡下觀察對照組及實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞的變化.

1.4 溶藻方式初探

感染了XD-G的中肋骨條藻裂解液經(jīng)孔徑為0.22μm的Millipore Millex-GP針頭式過濾器（改良聚醚砜）過濾,將裂解原液及濾液分別以體積比1∶5接種到對數(shù)生長期的中肋骨條藻培養(yǎng)液中,空白對照組加入過濾海水,感染1 d后,根據(jù)藻液的顏色變化判斷其溶藻效果,同時(shí)在光學(xué)顯微鏡下觀察藻細(xì)胞的顯微變化.

1.5 溶藻細(xì)菌的透射電子顯微鏡觀察

感染菌株XD-G的中肋骨條藻裂解液按1%的體積比接種至對數(shù)生長期的中肋骨條藻培養(yǎng)液中,空白對照組加入過濾海水.接種9 h后,分別取空白對照組及實(shí)驗(yàn)組的樣品各4 mL,經(jīng)12 000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀中加入2.5%的戊二醛,4℃下固定,固定后的樣品送往中國科學(xué)院病毒研究所制備電鏡切片并觀察.

1.6 溶藻細(xì)菌的溶藻范圍試驗(yàn)

感染菌株XD-G的中肋骨條藻裂解液按體積比1∶2加入到處于對數(shù)生長期的利馬原甲藻、東海原甲藻、海洋原甲藻、微小原甲藻、錐狀斯克里普藻、赤潮異彎藻、熱帶骨條藻、旋鏈角毛藻、尖刺偽菱形藻及球等鞭金藻培養(yǎng)液中,每個(gè)藻種做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),對照組加入過濾海水,置于溫度為20±0.5℃的光照培養(yǎng)箱中.感染數(shù)天后,根據(jù)藻培養(yǎng)液的顏色變化及光學(xué)顯微鏡下觀察藻細(xì)胞的變化判斷其溶藻效果.

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻微生物的分離結(jié)果及其溶藻效果

從寧波象山港西店養(yǎng)殖區(qū)分離到裂解中肋骨條藻的微生物,命名為 XD-G,裂解液反復(fù)感染中肋骨條藻,藻培養(yǎng)液的顏色都由褐色變?yōu)闇\綠色.光學(xué)顯微鏡下觀察,空白對照組的藻細(xì)胞完整,內(nèi)可見數(shù)個(gè)色素顆粒,幾個(gè)單細(xì)胞由刺串成細(xì)胞長鏈,可見空白對照組的藻細(xì)胞生長正常.而感染XD-G的藻培養(yǎng)液中,藻細(xì)胞已基本裂解,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放在外面,可見實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞已裂解死亡.除藻效率以葉綠素a的減少為依據(jù),如圖1所示,感染XD-G1 d后,中肋骨條藻培養(yǎng)液的葉綠素a含量減少達(dá)66.5%.

圖1 XD-G感染中肋骨條藻1 d的溶藻效果Fig.1 The algae-lysing effect of the XD-G to S.costatum1 115 in 1 day

2.2 溶藻方式

光學(xué)顯微鏡下觀察,感染了XD-G的中肋骨條藻培養(yǎng)液中,藻細(xì)胞已基本裂解,但是,XD-G裂解液經(jīng)孔徑為0.22μm的Millipore Millex-GP針頭式過濾器（改良聚醚砜）過濾后,其濾液對中肋骨條藻無溶藻效果,藻細(xì)胞生長正常.由此推測,該溶藻微生物既不是藻類病毒,也不是分泌胞外溶藻物質(zhì)的細(xì)菌,可能是一種直接接觸溶藻或者是與中肋骨條藻競爭有限營養(yǎng)物質(zhì)溶藻的細(xì)菌.

2.3 菌株XD-G的透射電子顯微鏡觀察結(jié)果

對照組如圖2-1,可見單個(gè)藻細(xì)胞間由刺連接,藻細(xì)胞膜完整,細(xì)胞內(nèi)容物豐富,可見數(shù)個(gè)線粒體,即說明對照組中肋骨條藻細(xì)胞生長正常.試驗(yàn)組如圖2-2,可見感染菌株XD-G 9 h后實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞內(nèi)有大量細(xì)菌（箭頭所指）,個(gè)別藻細(xì)胞破裂,子代細(xì)菌正在釋放.由此推斷,菌株XD-G是一種寄生于中肋骨條藻內(nèi)生長繁殖的細(xì)菌.

圖2 感染菌株XD-G 9 h的中肋骨條藻電鏡切片（2-1為對照組,2-2為實(shí)驗(yàn)組）Fig.2 The electron microscopic section ofS.costatum 1115 after 9 hours'infection of XD-G.

2.4 菌株XD-G的溶藻范圍

菌株XD-G對其它藻種的裂解情況如表1所示,可以看到菌株XD-G不但可裂解中肋骨條藻,也可裂解熱帶骨條藻,而且對赤潮異彎藻也有一定的溶藻效果,但是該菌株對利馬原甲藻、東海原甲藻、海洋原甲藻、微小原甲藻、錐狀斯克里普藻、球等鞭金藻、旋鏈角毛藻、尖刺偽菱形藻均無溶藻效果.

表1 菌株XD-G的溶藻范圍Tab.1 Algae-lysing range of the bacteria XD-G

3 討論

細(xì)菌的溶藻機(jī)制主要分為兩類:一是間接溶藻,即細(xì)菌與藻細(xì)胞競爭有限營養(yǎng)物質(zhì)或細(xì)菌分泌胞外溶藻物質(zhì)而致使藻細(xì)胞死亡;二是直接溶藻,即細(xì)菌直接接觸藻細(xì)胞或進(jìn)去藻細(xì)胞中而造成藻細(xì)胞裂解死亡.Caiola M G等曾[18]在瓦雷澤湖爆發(fā)的水華中,使用電子顯微鏡觀察到直接攻擊銅綠微囊藻的類蛭弧菌.Lewis J等[19]用電子顯微鏡觀察到一種鞭毛細(xì)菌寄生于亞歷山大藻（A lexandrium spp.）細(xì)胞中.

本實(shí)驗(yàn)所分離到的菌株XD-G不但除藻效率高,接種1 d后,除藻效率可達(dá)66.5%,而且溶藻范圍也較廣,除了對中肋骨條藻和熱帶骨條藻有高效的溶藻效果外,還能裂解赤潮異彎藻.其中中肋骨條藻和赤潮異彎藻是常發(fā)赤潮原因種,國內(nèi)海域自2002年起每年都發(fā)生中肋骨條藻赤潮,特別是浙江沿海幾乎每年都發(fā)生數(shù)次此類赤潮[3-9].可見本研究的現(xiàn)實(shí)意義非常明確.

目前,有關(guān)溶中肋骨條藻細(xì)菌的報(bào)道主要集中于分泌胞外溶藻物質(zhì)的細(xì)菌.例如 Kato J等[20]從海水中分離得到4株能夠裂解中肋骨條藻的交替假單胞菌A27,A28,A29,A30,并通過進(jìn)一步研究證明海洋細(xì)菌Pseudoalterolnonas sp.A28是通過分泌一種胞外絲氨酸蛋白酶而溶解藻細(xì)胞的[21].由于自然水體中的營養(yǎng)物質(zhì)有限,不利于細(xì)菌的迅速生長,因此,此類溶藻細(xì)菌一般需將細(xì)菌分泌的胞外溶藻物質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)才能投入治理赤潮的實(shí)際應(yīng)用,而且由于赤潮發(fā)生面積比較大,溶藻物質(zhì)的需要量也會很大,一定程度上提高了赤潮治理的費(fèi)用.至今為止,國內(nèi)還未見關(guān)于以直接溶藻方式溶中肋骨條藻細(xì)菌的報(bào)道.國外曾有報(bào)道Cytophaga sp.J18/M01能夠直接攻擊中肋骨條藻,而且溶藻范圍廣,不但對中肋骨條藻具溶藻效果,還能溶解古老卡盾藻（Chattonella A ntique）、海洋卡盾藻（Chattonella Marina）、赤潮異彎藻、雙突角毛藻（Chaetoceros didymus）、長崎裸甲藻（Gymnodinium nagasakiense）等海洋微藻[22].在溶藻范圍方面,菌株 XD-G與Cytophaga sp.J18/M01相似,同時(shí)可對中肋骨條藻和赤潮異彎藻有溶藻效果,但是文獻(xiàn)中沒有明確指出Cytophaga sp.J18/M01是直接接觸溶藻還是進(jìn)入藻細(xì)胞溶藻.本實(shí)驗(yàn)分離得到的細(xì)菌XD-G經(jīng)電鏡切片觀察初步證實(shí)能進(jìn)入中肋骨條藻細(xì)胞內(nèi).目前報(bào)道進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)的溶藻細(xì)菌主要是類蛭弧菌[18,23],這類細(xì)菌寄生在宿主細(xì)胞的周質(zhì)空間內(nèi)生長增殖[23-24].盡管電鏡圖片中顯示菌株XD-G是在藻細(xì)胞內(nèi),但也不能排除細(xì)菌在周質(zhì)空間中增殖,在宿主細(xì)胞即將裂解時(shí)擴(kuò)散至宿主細(xì)胞內(nèi).推測該菌株可能是一種新型的寄生溶藻細(xì)菌.

菌株X-G寄生于中肋骨條藻細(xì)胞,并利用藻細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖,最終致使藻細(xì)胞裂解,釋放大量子代,這樣在赤潮治理的過程中無需投放大量的細(xì)菌,就能達(dá)到較好的除藻目的.此外,由于菌株XD-G在我國近海海域分離得到,在治理赤潮的實(shí)際應(yīng)用中的生態(tài)安全性會較高.因此,菌株XD-G可能可以成為赤潮治理的一種有力工具.但是由于赤潮的發(fā)生面積大,赤潮的生消受到多種因素的影響,要將菌株 XD-G應(yīng)用于赤潮的實(shí)際治理,還需對它做很多的研究,如環(huán)境因素對其溶藻效果的影響等.

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Abstract:An algae-lysing bacteria called XD-G was isolated from XiangShan bay in NingBo.The algicidal effect of the bacterium XD-G onS.costatum1115 is significant:almost all of the algal cells were lysed in 24 hours,and the concentration of Chl a was reduced by 66.5%then.By electron microscope observation,a large number of the bacterium could be observed inS.costatumcells after 9 hours'infection,which means that the bacteria XD-G is a kind of parasitic bacteria.Furthermore,the bacteria XD-G could not only lyseS.costatum1115 andSkeletonema troicum,but also removeHeterosigma akashiwo.

Key words:red tide;algicidal Bacteria;Skeletonema costatum1115;parasitic

Isolation and preliminary identification of a novel parasitic algicidal bacteria

XU Lina1,CHENG Kai1,XU Min1,ZHAO Yijun1,YAN GJifang2,CHEN Jigang2,WU Qingxi2
（1.Hubei Key Laboratory of Urban Water Environmental Ecology,Huazhong Normal University,Wuhan 430079;2.Municipal Key Laboratory of Microorganism and Environmental Engineering,Zhejiang Wanli College,Ningbo,Zhejiang 315100）

X55

A

1000-1190（2010）04-0658-04

2010-07-27.

國家海洋局公益性項(xiàng)目（200705014）;國家科技重大專項(xiàng)（2009ZX27105-001）;湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2008CDA101）.

＊通訊聯(lián)系人.E-mail:chengkaicn@163.com.