母銳敏， 賈靜靜， 張盛至

(1．山東建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟南 250101;2. 山東億能工程設(shè)計有限公司,山東 濟南 250101)

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溶藻細菌FS1的溶藻效果與機制初探

母銳敏1， 賈靜靜2， 張盛至1

(1．山東建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟南 250101;2. 山東億能工程設(shè)計有限公司,山東 濟南 250101)

近年來，由水體富營養(yǎng)化引發(fā)的藍藻水華頻繁暴發(fā)，對水體生態(tài)系統(tǒng)平衡產(chǎn)生了重大影響，給人類健康也帶來嚴(yán)重威脅。生物法除藻具有高效性、環(huán)境友好等優(yōu)點，因此，如果能獲得具有較高溶藻效率的溶藻細菌，選擇生物法除藻更為理想。從菏澤一富營養(yǎng)化池塘分離得到1株溶藻細菌FS1，經(jīng)16S rDNA測序分析鑒定為芽胞桿菌屬。實驗以銅綠微囊藻為研究對象，采用血球計數(shù)板法計算反應(yīng)前后藻細胞的濃度，對不同生長階段溶藻細菌FS1的溶藻效果進行了探究。停滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的除藻率分別為7.1%、24.3%、57.0%和45.5%，結(jié)果表明，處于穩(wěn)定期的FS1對銅綠微囊藻的去除效果最佳。細菌溶藻方式的研究結(jié)果表明，溶藻細菌是通過分泌溶藻物質(zhì)間接溶解藻細胞。

溶藻細菌；除藻率；溶藻方式；銅綠微囊藻

近年來，由水體富營養(yǎng)化引起的有害藻類水華頻繁暴發(fā)，嚴(yán)重影響著生態(tài)環(huán)境的平衡[1-3]，對人類的健康也產(chǎn)生了威脅。對于水體富營養(yǎng)化的治理，主要有物理方法、化學(xué)方法和生物方法[4-6]，但前兩者投資大，且對水環(huán)境產(chǎn)生二次污染[7-8]，而生物除藻由于具有高效性、環(huán)境友好等特點，使其作為生物控藻手段顯示出極大的潛力[9]。溶藻細菌被發(fā)現(xiàn)以來一直得到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。溶藻細菌的作用方式有直接溶藻和間接溶藻[10]，直接溶藻是溶藻細菌自身直接作用于藻細胞，使藻細胞溶解；間接溶藻是溶藻細菌通過分泌胞外溶藻物質(zhì)溶藻或者細菌同藻競爭營養(yǎng)物質(zhì)。本研究以水華常見藻類銅綠微囊藻為研究對象，溶藻細菌FS1分離自菏澤一富營養(yǎng)化池塘，針對溶藻細菌FS1對銅綠微囊藻的溶藻效果及其溶藻機理進行了初步探究，通過16S rDNA序列分析對FS1進行鑒定，并建立系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藻種 供試藻種為銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)，來源于中國科學(xué)院水生生物研究所藻種保藏中心(FACHB)，編號905，藻種活化后接種于BG11培養(yǎng)基中，置于人工氣候室中靜置培養(yǎng)，溫度25 ℃，光照強度2 500 Lx，光暗周期比12 h∶12 h[11]。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 細菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。液體LB培養(yǎng)基：NaCl 10，酵母粉5，胰蛋白胨10；固體LB培養(yǎng)基：NaCl 10，酵母粉5，胰蛋白胨 10，瓊脂15；銅綠微囊藻培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基[12]：NaNO31.500，K2HPO40.040，MgSO4·7H2O 0.075，CaCl2·2H2O 0.036，檸檬酸0.006，檸檬酸鐵胺0.006，EDTA-2Na 0.001，NaCO30.020，A51 mL/L(A5溶液配方(g/L)：H3BO32.860，MnCl2·4H2O 1.810，ZnSO4·7H2O 0.222，NaMOO4·2H2O 0.030，CuSO4·5H2O 0.079，Co(NO3)2·6H2O 0.049)。

1.1.3 儀器 高速冷凍離心機(CR21GⅡ)，立式壓力蒸汽滅菌器(澄醫(yī)LS-B35L型)，超凈工作臺(博科13BS-SDC)，恒溫搖床(上海天呈TS-100B)，顯微鏡(XSP-4C)，紫外分光光度計(VARIAN Cary50Probe)。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 用無菌移液管吸取1 mL取自富營養(yǎng)化池塘的水樣，加入9 mL無菌水中，制成10-1稀釋液，依此類推，制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度稀釋液[13-14]。各吸取0.2 mL稀釋液置于相應(yīng)編號的平板中，每個梯度3個平行樣，將平板倒置于人工氣候室中培養(yǎng)72 h后，采用劃線法進一步純化，得到純菌株。

1.2.2 細菌溶藻效果 挑取純化的菌落轉(zhuǎn)接到50 mL滅菌的液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至OD600值為2.0(菌體含量在109個/mL左右)。向菌液中按1∶3的比例加入150 mL稀釋藻液(將實驗室培養(yǎng)至穩(wěn)定期的銅綠微囊藻液稀釋10倍，藻細胞個數(shù)在107個/mL左右)。4 d 內(nèi)觀察溶藻效果。采用血球計數(shù)板計數(shù)方法[15]對藻細胞進行計數(shù)，根據(jù)藻細胞數(shù)量的變化描述溶藻效果。

本研究中計數(shù)板為1 mm×1 mm方格25×16型，計數(shù)時，數(shù)左上、左下、右上、右下和中間5個(80小格)藻細胞數(shù)，計算公式：

藻細胞數(shù)(mL)=(80小格細胞總數(shù)/80)×400×10 000×稀釋倍數(shù)

式中,C1為實驗組藻細胞數(shù)，C2為對照組藻細胞數(shù)。

1.2.3 細菌溶藻方式 將細菌轉(zhuǎn)接到50 mL液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至OD600值為2.0(菌體含量在109個/mL左右)，制成原菌液。采取高溫滅菌和高速離心處理原菌液[15-17]，得到高溫滅菌(121 ℃，20 min)后的菌液、離心(12 000 r/min，20 min)沉降后的上清液和離心后的菌體。離心后的菌體加入150 mL無菌水，制成菌懸液。按1∶3的比例加入150 mL稀釋藻液，對照組為50 mL液體培養(yǎng)基加150 mL稀釋藻液。放入搖床(30 ℃，180 r/min)中反應(yīng)，4 d內(nèi)觀察對比溶藻效果。

1.2.4 細菌生長曲線 用無菌移液管吸取1 mL 1.2.3中培養(yǎng)的原菌液于200 mL滅菌的培養(yǎng)基中，再于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，進入穩(wěn)定期前每隔1 h取樣，進入穩(wěn)定期后每隔2 h取樣，用分光光度計在600 nm處測取菌液吸光度值，繪制生長曲線[18]。

1.2.5 細菌不同生長期對銅綠微囊藻生長的影響 根據(jù)1.2.4中的生長曲線，分別選取處于停滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期菌液。向菌液中按1∶3的比例加入150 mL稀釋藻液，設(shè)置對照組，對照組為50 mL滅菌的培養(yǎng)基加150 mL稀釋藻液。加入藻液4 d內(nèi)觀察溶藻效果。

1.2.6 16S rDNA序列分析 16S rDNA序列的相似性分析有助于溶藻細菌的分子生物學(xué)研究，也是溶藻細菌屬性分類的關(guān)鍵指標(biāo)[19]。本研究溶藻細菌FS1的16S rDNA序列分析由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測定。對測定的溶藻細菌FS1的16S rDNA序列應(yīng)用Blast程序和GenBank中的已知序列進行相似性對比，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析，建立系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻細菌分離

從水樣中分離得到6株細菌，編號為FS1～FS6，其中FS1的溶藻效果最為明顯，其菌落為微凸型白色圓形菌落。

FS1菌液剛加入藻液時與加入藻液4 d后進行對比。加入藻液4 d后，對照組仍為綠色；實驗組中的菌藻混合液由綠色變成黃色，最終完全黃化。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，視野中藻細胞的數(shù)量明顯減少。通過對比可知，在溶藻細菌FS1的作用下，藻細胞大量死亡并且葉綠素被破壞，所以藻菌混合液顏色變黃，可初步判定細菌FS1為溶藻細菌。圖1為對照組和實驗組中藻細胞的數(shù)量變化對比，根據(jù)1.2.2中除藻率計算公式，計算出加入藻液后1、2、3和4 d的除藻率分別為32.6%、42.8%、51.2%和54.8%，具有顯著的溶藻效果。

圖1 對照組與實驗組藻細胞數(shù)量變化Fig.1 The changment of control group and experimental group with Microcystis aeruginosa cells

2.2 溶藻細菌FS1的溶藻方式

反應(yīng)4 d后，不同方式處理后菌液的溶藻效果如圖2所示，原菌液和上清液的除藻率分別為54.8%和62.0%，高溫?zé)崽幚硪汉途鷳乙旱某迓史謩e為6.4%和9.6%。高溫?zé)崽幚砗途鷳乙旱娜茉逍Ч伙@著，然而菌懸液的除藻率高于高溫?zé)崽幚硪?，說明實驗過程中菌懸液中的細菌恢復(fù)了溶藻能力，但是處于無菌水中的菌體沒有在液體培養(yǎng)基中活性高，所以溶藻效果與原菌液差距較大。上清液仍有較好的溶藻效果，而菌懸液除藻率僅為9.6%，說明細菌FS1不是與藻細胞直接接觸溶藻，而是通過分泌溶藻物質(zhì)間接溶藻[20]。

圖2 反應(yīng)4 d后不同方式處理后的FS1菌液的溶藻效果Fig.2 The algicidal effect of bacterium FS1 with different treatment after four days

2.3 細菌生長曲線的測定

由圖3可看出細菌FS1在0～1 h處于停滯期，1～8 h處于對數(shù)生長期，8～18 h處于穩(wěn)定期，18 h后進入衰亡期。FS1是從液體培養(yǎng)基接種到液體培養(yǎng)基，生長環(huán)境基本沒變，停滯期較短。參考《微生物學(xué)實驗》[21]代時計算公式，計算出代時G=1.93 h，因為代時短細菌生長速率大，濃度增長快，所以溶藻細菌FS1能夠在短時間內(nèi)滿足溶藻對細菌濃度的要求[16]。

圖3 細菌FS1的生長曲線Fig.3 Growth curve of bacterium FS1

2.4 細菌不同生長期對銅綠微囊藻的溶解效果

不同生長期菌液的溶藻效果如圖4所示。停滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的除藻率分別為7.1%、24.3%、57.0%和45.5%。不同生長期的細菌均有一定的溶藻效果，但停滯期和對數(shù)期的菌液的溶藻能力遠不及穩(wěn)定期和衰亡期，這可能與細菌在生長階段合成的溶藻物質(zhì)積累有關(guān)，對于間接溶藻的細菌FS1來說，溶藻物質(zhì)越多除藻率越高，穩(wěn)定期和衰亡積累的溶藻物質(zhì)最多，溶藻效果最好。但衰亡期的除藻率低于穩(wěn)定期，推斷是衰亡期的次代謝產(chǎn)物對溶藻效果產(chǎn)生了一定的抑制作用。盧蘭蘭等[22]也討論了溶藻細菌不同生長期的溶藻效果，穩(wěn)定期與衰亡期的溶藻能力最強。

圖4 反應(yīng)4 d后不同生長期菌液的溶藻效果Fig.4 The algicidal effect of different growth periods after four days

2.5 溶藻細菌FS1的16S rDNA序列分析

將FS1的16S rDNA序列分析結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast相似性檢索分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，建立系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖5)。由圖5可知，F(xiàn)S1與芽胞桿菌同源性為99%，初步鑒定為芽胞桿菌屬，GenBank中收錄號為KC523393。

圖5 溶藻細菌FS1系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of bacterium FS1

3 討 論

本文以探究藍藻水華的微生物控制為目的，選擇導(dǎo)致藍藻水華暴發(fā)的常見藻類銅綠微囊藻為研究目標(biāo)，詳細研究了溶藻細菌FS1的溶藻特性，初步探究了FS1的溶藻機理，并從分子生物學(xué)水平上對溶藻細菌FS1進行了鑒定。

細菌溶藻技術(shù)研究的基礎(chǔ)是溶藻細菌的分離，篩選出高效、專一的溶藻細菌，并開發(fā)出安全、高效的生物殺藻劑，已日漸成為控制與治理藍藻水華的新思路。本研究以藍藻水華水體為分離源，共分離出6株純細菌，選擇溶藻效果顯著的FS1溶藻細菌作為實驗菌株，對溶藻細菌FS1利用16S rDNA序列分析方法進行鑒定，通過序列同源性比較分析和建立系統(tǒng)發(fā)育樹表明溶藻細菌FS1屬于芽胞桿菌屬。對FS1的溶藻機理進行初步探究，研究不同方式處理的菌液的溶藻效果，結(jié)果表明，上清液的溶藻效果最好。通過分析得知FS1是通過釋放溶藻物質(zhì)間接溶藻，釋放的胞外溶藻物質(zhì)為非耐高溫物質(zhì)，在高溫下失去溶藻活性。溶藻細菌的溶藻效果與細菌生長周期密切相關(guān)。對FS1處于停滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的菌液進行溶藻效果研究，結(jié)果表明，F(xiàn)S1對銅綠微囊藻的溶藻效果在穩(wěn)定期最好，衰亡期次之。這可能與細菌在生長階段合成的溶藻物質(zhì)積累有關(guān)，隨著細菌的生長溶藻物質(zhì)積累越多，溶藻效果越好，而在衰亡期，產(chǎn)生的次代謝產(chǎn)物對溶藻效果產(chǎn)生了一定的抑制作用。

本研究中分離的溶藻細菌FS1來源于自然水體，與環(huán)境有很好的相容性，與其他來源的細菌相比安全性更高，溶藻能力更具有針對性。由于FS1是通過分泌溶藻物質(zhì)間接溶解藻細胞，對不同生長期細菌的溶藻效果進行研究是為了確定細菌何時溶藻效果最強，進而為今后的實際應(yīng)用提供參考。生物除藻法是利用生物間的營養(yǎng)競爭和食物鏈關(guān)系來控制藍藻水華，從整個生態(tài)系統(tǒng)的管理角度深入，具有經(jīng)濟性、合理性和高效性的特點，將成為控藻的主要手段。

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Initial Investigation on Algicidal Effect and Mechanism of Algae-lytic Bacteria FS1

MU Rui-min1, JIA Jing-jing2, ZHANG Sheng-zhi1

(1.Schl.ofMuni. &Environm’lEngin.,ShandongArchitec.Uni., 2.ShandongYiNengEngineeringDdsignCo.,Ltd,Jinan250101)

In recent years, frequent breaking out of algal blooms caused by eutrophication of waters have affected balance of waters ecological system eventfully, also seriously threatened human health. The algae elimination with biological method has the advantages of efficiency and environmental friendly. Therefore, it is an ideal matter to select biological method to eliminate the algae if a fairly effective an algae-lytic bacterium could be obtained. In this study, an algae-lytic bacterium named FS1 was isolated from an eutrophication pond in Heze, and identified asBacillussp. by the 16S rDNA sequence analysis. The experiment tookMicrocystisaeruginosaas the subject of the study. The algae-lytic effect of the algae-lytic bacterium FS1 in its different stage of growth was investigated adopting hemacytometer to calculate the concentration of algae cell. The algicidal effect of FS1 in its stagnant, logarithmic, stationary, and declining periods were at 7.1%, 24.3%, 57.0%, and 45.5% respectively. The results showed that the bacterium FS1 in its stationary growth period had the best removal rates againstMicrocystisaeruginosa. The research result of algicidal mode suggested that the bacterium FS1 lysedM.aeruginosaby excreting algae-lytic substance to lyse the algae cell indirectly.

algae-lytic bacteria; algicidal rate; algae-lytic mode;Microcystis aeruginosa

國家自然科學(xué)基金(51078224)；山東省中青年科學(xué)家獎勵基金(BS2011SW024)；山東建筑大學(xué)博士基金(XNBS0910)

母銳敏 女，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向為水污染控制理論與技術(shù)研究。E-mail: ruiminmu@163.com

2014-04-01；

2015-01-15

Q939.99;X172

A

1005-7021(2015)06-0016-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.003