曾后清,朱毅勇*,包 勇,沈其榮,郭 凱,黃思齊,楊志敏

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,江蘇南京210095;2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京210095)

磷是植物生長的一種重要營養(yǎng)元素。施入土壤中的磷肥大部分被土壤中的鐵鋁氧化物所吸附或與土壤中的鈣形成沉淀,還有一部分轉(zhuǎn)化為有機磷。因此,磷在土壤中的有效性較低,是造成植物缺磷的一個主要原因。在缺磷脅迫下,植物根系通常會產(chǎn)生大量的側(cè)根來擴大根系在土壤中的吸收面積。由于側(cè)根的發(fā)生與磷的有效性有很好的相關(guān)性,因此一直受到研究者的關(guān)注[1-2]。研究表明,缺磷對側(cè)根的形成在某種程度上依賴于生長素作用;缺磷時植物側(cè)根對生長素的敏感性提高[3],并影響生長素在根系中的分布[4]。此外,側(cè)根發(fā)生過程中生長素信號還受到轉(zhuǎn)錄因子NAC1的介導(dǎo),其表達(dá)強度與生長素濃度、側(cè)根的發(fā)生量呈高度正相關(guān)[5-6]。最近在擬南芥中發(fā)現(xiàn),NAC1的表達(dá)受到miR164的調(diào)控。miR164與NAC1 mRNA特異性結(jié)合,引起NAC1 mRNA降解,進而影響側(cè)根的發(fā)育與形成[7]。但是,植物在缺磷情況下側(cè)根發(fā)生是否與miR164及其靶基因NAC1有關(guān),國內(nèi)外尚未見報道。

MicroRNA(miRNA)是近年來在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源具有調(diào)控其他基因表達(dá)的、非編碼(蛋白質(zhì))的小分子 RNA,長度為20～ 24 nt[8]。目前對miRNA作用機制的研究顯示,成熟的miRNA先與RISC(RNA-induced silencing complex)的復(fù)合物結(jié)合,再特異性地與堿基互補的同源mRNA配對結(jié)合,若是堿基完全互補,則引起靶 mRNA的降解[9];若miRNA與靶mRNA不完全互補時,則與對應(yīng)的靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄后翻譯[10-11]。前者主要存在于植物中,而后者主要在動物中比較常見。miRNA主要參與基因后轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,通過調(diào)節(jié)其對應(yīng)的靶基因來控制植物生長發(fā)育,包括根、葉、花和輸導(dǎo)組織的形態(tài)發(fā)生與分化等[12-16]。此外,miRNA在調(diào)節(jié)植物對干旱、鹽害及植物養(yǎng)分等環(huán)境脅迫的反應(yīng)方面也起著重要作用[17]。番茄是一種重要的蔬果,也是研究根系形態(tài)發(fā)育(如側(cè)根和根毛)的模式植物。因此,本試驗利用番茄幼苗研究了不同供磷水平下根系的形態(tài)變化和磷素缺乏情況下側(cè)根發(fā)生與生長素的關(guān)系,以及缺磷情況下其根系中調(diào)控生長素信號的轉(zhuǎn)錄因子NAC1與miR164在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)關(guān)系,為研究植物在缺磷脅迫下的生理機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)和處理

番茄(Lycopersicon esculentum)品種為蘇紅 2008(江蘇省農(nóng)科院提供)。種子用2%的次氯酸鈉消毒8 min,在1 mmol/L CaSO4溶液中浸泡6 h后于 22℃黑暗中發(fā)芽。2 d后將露白的種子均勻地播在漂浮于營養(yǎng)液面的尼龍網(wǎng)上。營養(yǎng)液組成為:0.7 mmol/L Ca(NO3)2、0.5 mmol/L NH4H2PO4、1.5 mmol/L KNO3、4.75 μ mol/L FeSO4、0.5 mmol/L Mg-SO4 、11.5 μ mol/L H3BO3 、1.25 μ mol/L MnCl2 、0.2 μ mol/L ZnSO4 、0.32 μ mol/L CuSO4 、0.025 μ mol/L H2MoO4和 4.75 μ mol/L Na2EDTA(pH 5.5)。對 于磷濃度處理,加入 0、0.005、0.05、0.5 mmol/L NH4H2PO4,不足0.5 mmol/L的部分以NH4Cl代替。植物在生長箱中培養(yǎng),溫度為23℃,每天光照12 h。營養(yǎng)液每天更換一次,到第5 d時采樣分析。外加生長素抑制劑與外源生長素的濃度分別為50 nmol/L NPA與10 nmol/L NAA,在每天更換營養(yǎng)液時根據(jù)試驗設(shè)計要求加入。由于所有番茄培養(yǎng)時間均為5 d,如無特別說明,則外加生長素抑制劑與外源生長素時間均為5 d,如加入時間為4 d,表示移栽1d后加入,依次類推;不加生長素抑制劑和外源生長素的為對照,試驗均重復(fù)3次。

1.2 測定項目與方法

根系形態(tài)分析:將番茄幼苗在莖與根的交界處切開,根長、側(cè)根數(shù)和側(cè)根原基測量在體視鏡下進行。根長,側(cè)根長用直尺測量,側(cè)根原基數(shù)在體視鏡下計數(shù)。

植物磷含量測定:將幼苗在液氮中迅速冷凍,研磨后稱取50 mg凍干粉溶解于50 mL 10%(v/v)TCA中,4℃往復(fù)振蕩15 min。12000×g離心5 min后取上清液,用鉬藍(lán)比色法測定磷含量[18]。

根系總RNA采用Trizol(Invitrogen)提取:由于成熟miRNA片斷太短,因此先對其進行polyA加尾處理[16]。 反應(yīng)體系 為 25 μ L(1.5 μ g total RNAs、1 mmol/L ATP、2.5 mmol/L MnCl2和 2 U polyA polymerase),反應(yīng)條件37℃60 min。加尾后的RNA直接進行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系為 25 μ L,其中含有12.5 μ L ployA加尾的產(chǎn)物,0.5 mmol/L dNTP,200 UMMLV 反轉(zhuǎn)錄酶(Promega),1 μ L 錨 定引物[5′-CGAACATGTACAGTCCATGGATAG d(T)30(A,G or C)(A,G,C or T)-3′],獲得 cDNA 產(chǎn)物。以 EF-1a作為內(nèi)參,其擴增所用引物為:正義鏈 5′-AGACCACCAAGTACTACTGCAC-3′;反 義 鏈 5′-CCACCAATCTTGTACACATCC-3′。擴增NAC1 的引物為:正義鏈 5′-CCCTTGGACTTTGATACAC-3′;反 義 鏈 5′-TGGCTTTCC AGTAACCAGATACG-3′。擴增miR164的引物為:正義鏈即為miRNA序列,反義鏈為加尾所含序列(5′-CGAACATGTACAGTCCATGGATAG-3′)。 反 應(yīng) 體系:25 μ L[包括 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、50mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、0.01%Gelatin 、0.01%Triton X-100、0.2 mmol/L dNTP、2U Taq DNA polymerase(TaKaRa)、0.5mmol/L primer]。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min。25循環(huán):1)94℃變性,30 s;2)72℃退火,30 s;3)65℃延伸,40 s,最后保持72℃,5 min。

實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 13.0進行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷有效性對番茄幼苗根系形態(tài)的影響

番茄種子發(fā)芽后,直接轉(zhuǎn)移到含有不同磷濃度的營養(yǎng)液中。培育5 d后發(fā)現(xiàn),完全缺磷營養(yǎng)下的番茄幼苗側(cè)根數(shù)量最多,平均有6條;5 μ mol/L Pi處理下的幼苗平均有5條側(cè)根。當(dāng)磷濃度達(dá)到50 μ mol/L時,側(cè)根數(shù)目明顯減少,僅有 2～3條;當(dāng)磷濃度達(dá)到500 μ mol/L時,側(cè)根數(shù)量平均為1條(圖1A)。同時,側(cè)根的總長度也隨著營養(yǎng)液中磷濃度的升高而降低,其變化趨勢與側(cè)根數(shù)目的變化一致(圖1B)。相比之下,培養(yǎng)5 d后主根的長度在0～5 μ mol/L磷濃度范圍內(nèi)無顯著差異,而且比50～500 μ mol/L磷濃度下培養(yǎng)的主根略長一些(圖1C)。幼苗體內(nèi)的磷含量隨著營養(yǎng)液中磷濃度的增高而顯著增加(圖1D)。

為了避免完全缺磷可能帶來的其他影響,我們選取了 5 μ mol/L 和 500 μ mol/L 的供磷濃 度作為缺磷脅迫處理(-P)與供磷對照(+P)進行以下研究。

圖1 不同供磷濃度下番茄幼苗的根系形態(tài)及其體內(nèi)磷含量Fig.1 Morphology of root system and phosphate content of tomato seedlings cultivated under different P levels

2.2 生長素對番茄幼苗側(cè)根發(fā)育的影響

生長素是影響根系形態(tài)變化的一個重要因素。在缺磷與供磷營養(yǎng)液中分別加入生長素運輸抑制劑NPA和外源生長素NAA,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在外加NPA的情況下,缺磷和供磷植物的側(cè)根發(fā)生都受到強烈的抑制,植株幾乎沒有長出側(cè)根;而加入NAA后,供磷植物也產(chǎn)生了大量的側(cè)根,與不加NAA的缺磷植物的側(cè)根數(shù)目相近;缺磷植物在外加NAA的情況下,也產(chǎn)生了更多的側(cè)根,并且有顯著差異(圖2A)。植物側(cè)根的總長度變化在外加NPA與NAA時,與側(cè)根的發(fā)生量變化一致(圖2B)。除了側(cè)根以外,側(cè)根原基的數(shù)目在NPA的處理下也受到明顯的抑制,外加NAA顯著促進了側(cè)根原基的數(shù)目(圖2C)。

2.3 磷有效性與生長素運輸對側(cè)根發(fā)育的交互作用

為了進一步研究缺磷誘導(dǎo)側(cè)根發(fā)生與生長素之間的關(guān)系,將缺磷番茄幼苗用NPA進行不同時間段的連續(xù)處理5 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn),移栽1和2 d后用NPA處理,即連續(xù)處理4和3 d,幾乎完全抑制了側(cè)根形成(圖3A),側(cè)根的伸長生長也相應(yīng)地受到抑制(圖3B)。相比之下,移栽3～4 d后的缺磷幼苗用NPA連續(xù)處理2和1 d,雖然也減少了側(cè)根的形成數(shù)量,但與對照相比,僅減少了30%(圖3A)。因此,第3和第4 d是側(cè)根形成的重要時期。相對而言,側(cè)根的伸長生長卻受到了強烈的影響,表現(xiàn)為側(cè)根總長度下降了80%(圖3B)。為了明確生長素對側(cè)根形成早期的調(diào)控影響,觀察了NPA處理對側(cè)根原基數(shù)量的發(fā)生的影響(圖3C),結(jié)果發(fā)現(xiàn),連續(xù)3和4 d的NPA處理均明顯減少了側(cè)根原基的數(shù)量,達(dá)50%以上;連續(xù)用NPA處理1及2 d對側(cè)根原基數(shù)量的抑制分別減弱為20%和30%左右。與側(cè)根形成數(shù)量受NPA抑制的結(jié)果相比(圖3A),生長素抑制劑NPA對側(cè)根原基是否發(fā)育成側(cè)根的影響更大。

圖2 生長素抑制劑NPA與外源生長素NAA對缺磷與供磷番茄幼苗側(cè)根發(fā)育的影響Fig.2 Effect of NPA and NAA on the development of tomato lateral roots under P deficiency and sufficient conditions

圖3 不同時間段NPA處理對缺磷番茄側(cè)根發(fā)育的影響Fig.3 Effect of NPA on the development of tomato lateral roots under P deficiency

2.4 NAC1與miR164在側(cè)根形成過程中的表達(dá)變化

為了驗證轉(zhuǎn)錄因子NAC1與miR164在側(cè)根發(fā)育過程中可能的作用,本試驗觀察了番茄根系側(cè)根發(fā)生的過程。如圖4A所示,番茄幼苗從第3 d開始長出側(cè)根,到第4 d時是側(cè)根大量形成的時期。通過半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),在第3和第4 d的24 h中NAC1在缺磷植物與供磷植物的根系中的表達(dá)都有上升的趨勢,但缺磷植物的NAC1表達(dá)量要明顯高于供磷植物。與此同時,miR164的表達(dá)量在缺磷植物中始終低于供磷植物(圖4B)。

3 討論

土壤中磷素缺乏的主要原因是磷在土壤中容易被固定,移動性差,因此截獲是植物根系獲得土壤中磷素的一個主要方式。植物根系通過分枝,產(chǎn)生大量側(cè)根以擴大吸收范圍。本試驗中,隨著營養(yǎng)液中供磷濃度的降低,側(cè)根數(shù)逐漸增加,側(cè)根總長度也隨之增加,與磷有效性之間體現(xiàn)了較好的負(fù)相關(guān)(圖1)。說明外界環(huán)境中磷的有效性是決定植物根系形態(tài)變化的一個重要因素。相比之下,主根的長度與外界供磷濃度之間沒有類似的關(guān)系。主根在缺磷脅迫下(0～ 5 μ mol/L)比不缺磷時(50～ 500 μ mol/L)略有伸長。類似的情況在擬南芥中也有發(fā)現(xiàn)[3],并且只有在供磷水平低于50 μ mol/L時,根系鮮重才顯著增加;但是在各個低磷濃度處理之間無顯著差異。結(jié)合本試驗結(jié)果(圖1A、C),在缺磷脅迫下,植物根系(包括主根與側(cè)根)生長得到了促進;同時從圖1D可知,外界磷濃度是造成植物體內(nèi)磷含量差異的一個主要原因。

圖4 番茄幼苗根系發(fā)育過程及其側(cè)根發(fā)育過程中NAC1與miR164的表達(dá)變化Fig.4 Root morphology of tomato seedlings and expression pattern of NAC1 and miR164 during the development of lateral roots

根系形態(tài)的改變與外界環(huán)境中供磷水平密切相關(guān),但最終是通過影響植物體內(nèi)的激素調(diào)控來實現(xiàn)的。在本試驗中(圖2A),外加生長素運輸抑制劑NPA嚴(yán)重抑制了缺磷植物的側(cè)根發(fā)生,而施用外源生長素NAA則導(dǎo)致供磷植物也產(chǎn)生大量的側(cè)根。說明缺磷時番茄幼苗側(cè)根的生長依賴于生長素;相應(yīng)的,側(cè)根長度的變化也與此一致(圖2B)。盡管側(cè)根原基的數(shù)量變化也有上述類似的趨勢(圖2C),但是供磷植物所形成的側(cè)根原基亦達(dá)到缺磷植物的75%左右,即使在加入生長素抑制劑NPA的情況下,無論供磷還是缺磷植物的側(cè)根原基數(shù)量都沒有完全受到抑制,相比之下側(cè)根形成則完全受到抑制(圖2A)。此外,即使加入了外源生長素NAA后,供磷和缺磷植物所增加的側(cè)根原基數(shù)量也很少,這與NAA處理下側(cè)根大量形成有著明顯的差別。說明側(cè)根原基的形成也需要生長素,但是對生長素的敏感性及依賴性不如側(cè)根發(fā)生過程時那么強烈。由此可知,缺磷是誘導(dǎo)側(cè)根原基增多的一個主要原因,缺磷信號通過植物體內(nèi)的生長素使更多的側(cè)根原基發(fā)育成側(cè)根。

由于生長素是在植物的地上部分合成并運輸?shù)礁到M織,因此生長素的極性運輸決定了生長素在根系中的濃度與分布[19]。NPA是抑制生長素極性運輸?shù)囊环N化學(xué)試劑。通過NPA對缺磷脅迫下的番茄幼苗進行處理時發(fā)現(xiàn),前期開始處理徹底抑制了側(cè)根的形成,而后期處理則無法完全抑制側(cè)根的形成(圖3A)。表明前期處理可能導(dǎo)致缺磷誘導(dǎo)產(chǎn)生的生長素在向地性運輸過程中受到抑制而無法在根系中積累,以至于側(cè)根形成受阻。盡管側(cè)根原基的數(shù)量并沒有受到完全的抑制(圖3C),而后期NPA處理可能無法改變根系中已有的生長素的作用,植物仍能夠形成側(cè)根。但是,由于處理后生長素的運輸開始受到抑制,導(dǎo)致側(cè)根形成數(shù)量減少。相比之下,無論處理時間長短,側(cè)根的伸長生長都受到了NPA強烈的抑制(圖3B),說明生長素對側(cè)根的伸長生長影響更大。

NAC1是NAC家族中的一員,是一個轉(zhuǎn)錄因子,能激活生長素信號途徑中兩個下游基因DBP和AIR3。NAC1不僅本身受生長素誘導(dǎo),同時也調(diào)控生長素信號來促進側(cè)根的形成和發(fā)育。因此,NAC1的過表達(dá)與反義轉(zhuǎn)基因擬南芥分別顯示出側(cè)根增加與側(cè)根減少兩種表型[5]。從圖4A中可知,番茄幼苗生長到第3～4 d,是側(cè)根迅速形成的主要時期。在24 h之內(nèi)(圖4B),無論是缺磷還是供磷植物的NAC1表達(dá)都有上升的趨勢,但是缺磷植物的NAC1表達(dá)量明顯高于供磷植物。因此推測,在這個側(cè)根迅速形成的過程中,NAC1的表達(dá)增強是激活側(cè)根發(fā)育的重要原因之一。而與NAC1互補的miR164表達(dá)水平則始終表現(xiàn)為缺磷處理比供磷要低,在趨勢上與NAC1的表達(dá)差異相反。說明miR164在缺磷脅迫時下調(diào),是NAC1的表達(dá)水平升高的一個重要原因,對缺磷植物大量形成側(cè)根起到重要的調(diào)控作用。但是缺磷又是如何來調(diào)控miR164的表達(dá),還有待進一步的研究。

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