張立營，趙懷龍，馬鳳龍，傅興倫，孫英姿，高 波

相思子毒素是從豆科藤本植物相思子（Abrus precatorius）的種子中提取的一種劇毒性高分子蛋白毒素，其含量約占種子2.8%～3.0%。小鼠的LD50為0.04 μg/kg，成年人攝入的致死劑量為 5.0～7.0 μg/kg，其毒性強(qiáng)度是蓖麻毒素（小鼠LD503.0 μg/kg）的70多倍，已被列為潛在的重要毒素戰(zhàn)劑和生物恐怖病原物質(zhì)之一[1-4]。

國外已有報(bào)道恐怖分子用相思子毒素作為恐怖襲擊的手段。美國陸軍醫(yī)學(xué)研究發(fā)展總部早在1991年對相思子毒素單克隆抗體進(jìn)行研究和應(yīng)用，而國內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道[5-8]。因此，無論是從國際生物武器核查角度，還是從防護(hù)目的，開展對相思子毒素的檢測研究都具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用相思子毒素毒蛋白免疫BALB/c小鼠制備了相思子毒素單克隆抗體，并對其進(jìn)行了鑒定。擬為發(fā)展高靈敏度的相思子毒素檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 相思子毒素、蓖麻毒素、蒴蓮根毒素、BALB/c小鼠、Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞系由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物所提供。胎牛血清、1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；Protein A-Sepharose CL-4B為GE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 BALB/c小鼠的抗原免疫 利用甲醛處理的相思子毒素毒蛋白作為抗原，經(jīng)腹腔注射免疫10只雌性BALB/c小鼠。初次免疫用弗氏完全佐劑乳化的抗原，3周后用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進(jìn)行第2次免疫，再過3周同樣用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進(jìn)行第3次免疫，3次免疫劑量均為100μg/只。每次免疫3次后后段尾靜脈采血，用間接ELISA方法檢測血清中的抗體效價(jià)，觀測免疫效果。

1.2.2 雜交瘤細(xì)胞的建立 細(xì)胞融合前2d用抗原于小鼠尾靜脈加強(qiáng)免疫1次，取小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞采用50%PEG2000融合按常規(guī)方法進(jìn)行融合。

1.2.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆 以10 μg/ml的相思子毒素為包被抗原，用ELISA方法，通過檢測雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清篩選陽性融合細(xì)胞，再對陽性孔中的細(xì)胞以有限稀釋法進(jìn)行3次細(xì)胞克隆，用抗體亞類測定試劑盒對克隆獲得的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行抗體亞類鑒定。將經(jīng)過抗體亞類鑒定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株接種到預(yù)處理的BALB/c小鼠腹腔中，制備腹水，并測定其分泌單抗的穩(wěn)定性。取生長良好，分泌穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞建株，擴(kuò)大培養(yǎng)后入液氮保存。

1.2.4 單克隆抗體的效價(jià)測定 分別將用不同的單克隆雜交瘤細(xì)胞株誘生的小鼠腹水行1/100稀釋，然后再以1/10稀釋率進(jìn)行梯度稀釋；以相思子毒素為包被抗原，應(yīng)用間接ELISA方法進(jìn)行抗體的效價(jià)檢測。

1.2.5 單克隆抗體的特異性鑒定 利用間接ELISA法，分別測定單抗與蓖麻毒素、蒴蓮根毒素的交叉反應(yīng)性。各種抗原按5 μg/ml的濃度包被96孔酶標(biāo)板，同時(shí)設(shè)陰、陽性對照。

1.2.6 單克隆抗體的純化 應(yīng)用A蛋白親和層析法純化腹水中的單克隆抗體。將腹水先通過硫酸銨沉淀進(jìn)行預(yù)處理，然后用ProteinA-Sepharose CL-4B親和層析，通過AKTA explorer100監(jiān)測純化色譜圖。

1.2.7 單克隆抗體的定量和SDS-PAGE鑒定 將純化獲得的單抗用BCA蛋白定量試劑盒測定抗體的濃度，并推算腹水中單抗的含量，并進(jìn)行SDSPAGE鑒定

2 結(jié) 果

2.1 免疫效果分析 用間接ELISA法對免疫后的小鼠血清抗體效價(jià)檢測表明，末次免疫小鼠血清抗體效價(jià)均在1∶8000以上，免疫效果良好，可以用于細(xì)胞融合。

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立 通過對融合后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測和篩選，并對陽性孔中的細(xì)胞經(jīng)過有限稀釋法進(jìn)行3次細(xì)胞克隆，結(jié)果顯示細(xì)胞融合率為78%，其中陽性細(xì)胞孔為8個(gè)，陽性率為7.2%。對4株強(qiáng)陽性細(xì)胞株進(jìn)行3次亞克隆后，得到4株單抗細(xì)胞株2D3、4E6、1C8和1E5。

2.3 單抗的亞類鑒定 根據(jù)抗體亞類測定試劑盒的方法， 分別用抗鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA試劑包被96孔酶標(biāo)板，測得2D3細(xì)胞株的亞類是 IgG1，4E6、1C8和 1E5細(xì)胞株的亞類均為Ig2b。

2.4 單抗的效價(jià)測定 用間接ELISA法分別對2D3、4E6、1C8和1E5雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水進(jìn)行效價(jià)測定，分別為 1∶1×107、1∶1×106、1∶1×105、1∶1×106。

2.5 單抗的特異性鑒定 利用間接ELISA法，分別測定單抗與蓖麻毒素、蒴蓮根毒素的交叉反應(yīng)性。結(jié)果表明，4株單抗與幾種毒素均無交叉反應(yīng)，說明所篩選出的單克隆抗體是特異的。

2.6 單克隆抗體的純化 AKTA explorer100監(jiān)測的純化色譜圖顯示，2D3細(xì)胞誘生的腹水經(jīng)蛋白A親和層析純化，獲得了單一的蛋白洗脫峰（圖1）。通過BCA蛋白定量試劑盒對純化抗體進(jìn)行定量測定，推算出腹水中單抗含量約為4.6 mg/ml。

圖1 Protein A-Sepharose CL-4B層析圖

2.7 單克隆抗體的SDS-PAGE鑒定 純化的單抗進(jìn)行還原性SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示：5倍稀釋腹水的SDS-PAGE結(jié)果為多條帶，純化后的IgG只有2條帶，上下2條帶分別為IgG的重鏈及輕鏈（圖2），分子量分別是 50、26 kDa，與理論值相符合。

圖2 純化單抗的SDS-PAGE鑒定結(jié)果

3 討 論

相思子毒素 （abrin）是存在于豆科植物相思（Abrus precatorius）種子中的一種毒蛋白，與蓖麻毒素（ricin）同為Ⅱ型核糖體失活蛋白（RIP）家族成員，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的植物毒素之一，毒性是普通化學(xué)武器的幾百倍。從第一次世界大戰(zhàn)起，經(jīng)美、英、加、法等國的研究，相思子毒素已經(jīng)成為一個(gè)成功的天然毒素戰(zhàn)劑[9，10]。

相思子毒素天然資源比較豐富，制備比較容易，并且借助當(dāng)今高度發(fā)達(dá)的生物工程技術(shù)手段，還能夠?qū)崿F(xiàn)大批量生產(chǎn)。相思子毒素中毒后無特異癥狀，出現(xiàn)癥狀時(shí)已經(jīng)造成機(jī)體嚴(yán)重的器質(zhì)性損害，給中毒的治療及預(yù)防帶來極大的難度，具備生物毒素武器典型特征，因此歷來為外軍所高度重視[3]。在2001年世界生物及毒素武器大會（BTWC）上，相思子毒素再次被列入重點(diǎn)核查清單，因此開展對相思子毒素的研究具有十分重要的意義[11，12]。

本研究利用相思子毒素免疫BALB/C小鼠制備了相思子毒素單克隆抗體，其與相思子毒素、蒴蓮根毒素?zé)o交叉反應(yīng)，表明此株單抗特異性較強(qiáng)，具備建立檢測試劑盒的可能，可作為檢測相思子毒素的核心試劑。

[1]Zemla AT,Ecale Zhou CL.Structural re-alignment in an immunogenic surface region of abrin A chain.Bioinform Biol Insights,2008,12:5-13.

[2]Zhou H,Zhou B,Ma H,et al.Selection and characterization of human monoclonal antibodies against Abrin by phage display.Bioorg Med Chem Lett,2007,17(20):5690-5692.

[3]李麗琴，鄭曉軍，陳樂貴，等.相思子毒素的分子特點(diǎn)及其在臨床的應(yīng)用前景.中國新藥雜志，2002，11(5):360-363.

[4]Ostin A,Bergstrom T,Fredriksson SA,et al.Solvent-assisted trypsin digestion of abrin for forensic identification by LC-ESI MS/MS.Anal Chem,2007,79(16):6271-6278.

[5]唐偉國.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷試劑的制備與應(yīng)用[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1996.12-14.

[6]Lin JY,Lee TC,Tung TC.Isolation of antitumor proteins abrin-A and abrin-B from Abrus precatorius[J].Int J Pept Protein Res,1998,12(5):311-317.

[7]Hedge R,Maiti TK,Podder SK.Purification and characterrization of three toxins and two agglutinins from abrus precatorius seed by using lactamyl-sepharose affinity chromatography[J].Analytical Biochemistry,1991,194:101-109.

[8]馬惠海，羅勝軍，王 哲.相思子毒素研究進(jìn)展.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，9：50-54.

[9]李小兵，謝光洪，周昌芳，等.相思子毒素2a的純化及鑒定.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，28(3)：310-313.

[10]Bhaskar AS,Deb U,Kumar O,et al.Abrin induced oxidative stress mediated DNA damage in human leukemic cells and its reversal by N-acetylcysteine.Toxicol In Vitro,2008,22(8):1902-1908.

[11]Garber EA.Toxicity and detection of abrin and abrin in beverages.J Food Prot,2008,71(9):1875-1883.

[12]李麗琴，鄭曉軍，陳樂貴，等.相思子毒素多克隆抗體研究.防化研究，2001，4：19-21.